羅佳佳，向晨瑩，劉攀道，胡 璇，唐 軍，王文強，劉國道，陳志堅

（1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 /農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，海南 儋州 571737）

世界范圍內(nèi)，超過50%的可耕作土壤為pH低于5.0的酸性土壤，并主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。在我國，有超過2 000萬hm2土壤為酸性土壤，占全國耕地面積的21%[2]。酸性土壤存在著多種限制作物生長的不利因素，主要包括金屬離子毒害 (如 Al3+、Fe3+、Mn2+等)和養(yǎng)分缺乏 (如 P、Ca、Mg等)[3]。在酸性土壤中，Al3+能通過阻礙細(xì)胞分裂和伸長而抑制根系生長，阻礙根系對礦質(zhì)營養(yǎng)和水分的吸收[4]。在長期進(jìn)化過程中，植物形成了一系列適應(yīng)鋁毒脅迫的機制。例如，植物受到鋁毒脅迫時，可以促進(jìn)根分泌有機酸，螯合根際鋁離子，阻止鋁進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的Al3+可被固定在細(xì)胞壁內(nèi)，或被有機酸螯合并隔離在液泡中，從而緩解鋁毒害[5]。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子 STOP(sensitive to proton rhizotoxi city)是Cys-2-His-2(C2H2)型轉(zhuǎn)錄因子家族成員[6]。C2H2鋅指蛋白(ZF)是核酸綁定蛋白，定位于細(xì)胞核中，起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[7]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，AtSTOP1含有4個高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域(ZF domain)，能調(diào)控下游耐鋁關(guān)鍵基因表達(dá)，如鋁激活表達(dá)蘋果酸轉(zhuǎn)運子AtALMT1(Aluminum acti vated malate transporter 1)、鋁敏感因子AtALS3(Aluminum sensitive 3)和檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白AtMATE1(Multidrug and toxic compound extrusion 1)[8-9]。 擬 南 芥stop1突變體對鋁極為敏感，根系生長嚴(yán)重受阻，這可能是由于耐鋁相關(guān)基因表達(dá)受阻所致[8]。近年來，在其他植物中，相繼克隆了與AtSTOP1同源的基因，如水稻(Oryza sativa)[10-12]和煙草(Nicotiana tabacum)[13]。因此，STOPs在植物抵御鋁毒脅迫中起重要的調(diào)控作用。

柱花草(Stylosanthes guianensis)起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重要的豆科牧草，可作為飼草喂養(yǎng)牲畜、作為綠肥覆蓋果園和改良土壤等[14-16]。柱花草具有較強的耐鋁毒能力，是研究植物適應(yīng)酸性土壤鋁毒脅迫機制的優(yōu)良材料[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，柱花草蘋果酸酶基因SgME1(malic enzyme)具有調(diào)控根系蘋果酸合成螯合鋁離子的功能，是柱花草耐酸鋁脅迫的重要基因[19]。目前，對柱花草耐鋁毒能力評價的研究較多，但其耐鋁毒的分子調(diào)控機制尚不清楚。因此，本研究以柱花草為材料，克隆獲得了柱花草兩個鋅指轉(zhuǎn)錄因子SgSTOP1和SgSTOP2，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，以期為進(jìn)一步探索柱花草適應(yīng)鋁毒脅迫的分子調(diào)控機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的8份圭亞那柱花草(Stylosanthes gui anensis)基因型分別為TPRC2001-1、TF268、TF305、TF387、TF238、TF278、TF207、TF323。柱花草種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 鋁處理和相對根長測定

參照Sun等[19]方法，挑選飽滿的柱花草種子剝?nèi)シN殼，80 ℃水浴3 min，冷卻后播種于浸潤500 μmol·L-1CaSO4溶液的濾紙上。柱花草幼苗根長至2 cm時，進(jìn)行2個鋁濃度處理，分別為0 μmol·L-1AlCl3(對照，CK)和 60 μmol·L-1AlCl3(鋁處理，Al)，每個處理設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。分別在處理 0和 24 h后，用根系掃描儀 (EPSON，日本)掃描根長圖像，并用根系分析軟件Image J(National Institutes of Health， 美 國 )統(tǒng) 計 根 長 (root

length, RL)， 然 后 根 據(jù) 公 式 (RLAl24 h- RLAl0 h)/(RLCK24 h- RLCK0 h) × 100% 計算相對根長。

1.2.2 柱花草根系總 RNA 提取和 cDNA 合成

參照 TRIzol(Invitrogen Inc，美國)方法提取鋁處理下TPRC2001-1根系總RNA：取0.1 g根系樣品加入 1 mL TRIzol提取液，充分研磨后加入 0.2 mL氯仿。室溫放置 5 min 后，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min。吸取上清，加入0.5 mL異丙醇，充分混勻后室溫放置 10 min。4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min 后，棄上清，用 75 % 乙醇洗滌沉淀。4 ℃，7 500 r·min-1離心 5 min 后，棄上清，風(fēng)干沉淀，加入DEPC水溶解RNA。

參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen Inc，美國)方法合成cDNA第一鏈：在PCR管中加入2 μg RNA、 1 μL Oligo(dT)18(100 nmol·μL-1)， 并 加 入ddH2O 補足體積至 10 μL。于 70 ℃ 保溫 5 min，冰浴 5 min。隨后分別加入 5 μL M-MLV 5 × Reaction Buffer，1.25 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，0.5 μL RNase 抑制劑 (25 U)和 1 μL M-MLV RT(200 U)。于 42 ℃ 反應(yīng) 60 min，70 ℃ 滅活 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3SgSTOPs全長 cDNA 克隆

參考柱花草鋁毒脅迫轉(zhuǎn)錄組結(jié)果[18]，篩選獲得SgSTOP1和SgSTOP2基因全長序列，根據(jù)基因序列，設(shè)計引物SgSTOP1-TL-F和SgSTOP1-TL-R,SgSTOP2-TL-F和SgSTOP2-TL-R(表1)。以根系cDNA為模板，通過PCR擴增SgSTOP1和SgSTOP2基因。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、目的片段回收、連接到克隆載體pEASY-T1(Takara公司)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和測序分析后，獲得SgSTOP1和SgSTOP2全長cDNA序列，并將序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)。SgSTOP1和SgSTOP2在NCBI上的序列號分別為MH795120和MH-795121)。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

運用DNAMAN進(jìn)行多序列比對分析；利用WoLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析；利用OCTOPUS(http://octopus.cbr.su.se/index.php)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽；采用MAGA(v5.05)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；采用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/)進(jìn)行蛋白Motif分析；利用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.5 實時熒光定量 PCR 分析

運用SYBR Green(Takara，日本)定量試劑盒進(jìn)行實時熒光定量PCR，用Rotor-Gene 3000系統(tǒng)(Corbett Research，澳大利亞)進(jìn)行反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)體系為：10 μL 2 × SYBR Green PCR master mix，6.4 μL Mili-Q 水 ，0.8 μL 10 μmol·L-1的引 物 ，2 μL 稀 釋100 倍的 cDNA 模板。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，94 ℃15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 次循環(huán)。相對表達(dá)量=目的基因表達(dá)量/看家基因(SgEF-1a)表達(dá)量，目的基因SgSTOP1、SgSTOP2和看家基因SgEF-1a的定量引物如表1所列。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 Microsoft Excel 2003 進(jìn)行作圖，用 SPSS19.0(SPSS Institute，美國)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，對鋁處理下不同柱花草基因型間進(jìn)行單因素方差分析，對基因在根和葉、CK和鋁處理間分別進(jìn)行t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁毒對柱花草相對根長的影響

60 μmol·L-1AlCl3處理顯著抑制柱花草根系生長，并且，柱花草的耐鋁能力表現(xiàn)出基因型差異。在 60 μmol·L-1鋁處理下，柱花草 TPRC2001-1 的相對根長最大，顯著大于其他7份基因型(P＜0.05)；TF268和TF305次之，TF323最小(圖1)。這表明，8份試驗材料中TPRC2001-1是耐鋁柱花草基因型。

2.2 柱花草SgSTOP1和SgSTOP2的克隆與序列分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[18]，獲得SgSTOP1和SgSTOP2基因序列，設(shè)計正向和反向引物，以鋁毒脅迫下TPRC2001-1根系cDNA為模板，擴增出SgSTOP1和SgSTOP2基因cDNA全長序列。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)，SgSTOP1和SgSTOP2基因全長序列與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，基因大小分別為 1 515、1 077 bp(圖 2)。SgSTOP1和SgSTOP2分別編碼504、358個氨基酸殘基，蛋白分子量分別為56.2和39.7 kDa，理論等電點分別為5.78、5.76，均為親水性蛋白質(zhì)。此外，利用在線軟件OCTOPUS預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，SgSTOP1和SgSTOP2均無跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。利用WoLF PSORT預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，SgSTOP1和SgSTOP2均定位于細(xì)胞核中，表明SgSTOP1和SgSTOP2具備作為轉(zhuǎn)錄因子的特點。

圖 2 SgSTOP1 和 SgSTOP2 全長 cDNA 克隆Figure 2 Full length cloning of SgSTOP1 and SgSTOP2

2.3 柱花草 SgSTOP1 和 SgSTOP2 多序列比對和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

CDD Tools預(yù)測表明，SgSTOP1和SgSTOP2屬

圖 3 SgSTOP1 和 SgSTOP2 保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Figure 3 Conserved domain prediction of SgSTOP1 and SgSTOP2

于ZF-C2H2家族成員，兩者分別含有2個Zn綁定位點，2個核酸綁定位點(圖3)。將SgSTOP1和SgSTOP2蛋白序列與已報道的不同物種STOPs進(jìn)行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)SgSTOP1和SgSTOP2與其他物種STOPs同源性較高。并且，SgSTOP1和SgSTOP2與其他同源蛋白均具有4個鋅指結(jié)構(gòu)域，其中，SgSTOP1的鋅指結(jié)構(gòu)均為C2H2型，而SgSTOP2具有3個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域和1個C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域。此外，STOPs蛋白在鋅指結(jié)構(gòu)域部分較保守，而N端或C端同源性均較低(圖4)。

圖 4 SgSTOP1 和 SgSTOP2 與其他 STOPs同源蛋白氨基酸比對分析Figure 4 Multiple alignment analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 with homologous plants

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，STOPs蛋白可以被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共 3類群 (圖 5)。柱花草 SgSTOP1和SgSTOP2同屬第Ⅲ類群。其中，SgSTOP1與赤小豆VuSTOP1屬同一分枝，相似性最高，達(dá)75.9%，而SgSTOP2與水稻ART1、擬南芥AtSTOP2和高粱SgSTOP1b同源性最高。此外，運用MEME軟件進(jìn)行蛋白Motif預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)STOPs蛋白包含 16個保守 Motifs(圖 5)。SgSTOP1和 SgSTOP2均含有完整的Motif1(ZF-C2H2結(jié)構(gòu)域)，表明兩者均屬于鋅指蛋白家族成員，可能具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。

圖 5 SgSTOP1和SgSTOP2與其他STOPs同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹及Motif分析Figure 5 Phylogenetic tree and Motif analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 with other STOP proteins

2.5 SgSTOP1和 SgSTOP2基因表達(dá)模式分析

本研究進(jìn)一步對SgSTOP1和SgSTOP2的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在正常生長條件下，SgSTOP1和SgSTOP2在根和葉中均有表達(dá)，且SgSTOP1在葉部的表達(dá)量高于根部，而SgSTOP2在根部的表達(dá)量高于葉部(圖6A)。相比對照(CK)，鋁處理(Al)顯著增強了SgSTOP1基因在根部和葉部中的表達(dá)，但對SgSTOP2基因在根部和葉部的表達(dá)均無顯著影響(圖6B、C)。

圖 6 柱花草 SgSTOP1 和 SgSTOP2 基因的表達(dá)分析Figure 6 Expression analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 genes

3 討論與結(jié)論

鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一，不同植物或基因型對鋁毒害忍耐能力不一樣[20]。起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)的植物被認(rèn)為對酸性土壤鋁毒害具有較強的適應(yīng)性[21]。研究表明，柱花草具有較強的耐鋁毒害能力，但表現(xiàn)出基因型差異，其中，柱花草TPRC2001-1耐鋁毒能力與水稻“XN1”相當(dāng)[20]。本研究比較了8份柱花草基因型耐鋁能力差異，發(fā)現(xiàn)TPRC2001-1的相對根長顯著高于其他7份材料，進(jìn)一步表明TPRC2001-1是耐鋁柱花草基因型(圖1)。在此基礎(chǔ)上，本研究在TPRC 2001-1中克隆了柱花草鋅指轉(zhuǎn)錄因子SgSTOP1和SgSTOP2基因 (圖 2)。

近年來，對C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子STOPs功能研究較為廣泛，STOPs基因在植物耐鋁毒害中起重要作用[6, 8, 22]。在擬南芥中，具有 2 個 STOPs，在大豆(Glycine max)中，具有3個STOPs，在水稻中，具有1個STOPs的同源蛋白OsART1，在高粱中，具有4個STOPs[22-24]。STOPs轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由23～27個氨基酸殘基組成，含有兩個保守的半胱氨酸和組氨酸殘基[7]。在本研究中，SgSTOP1和SgSTOP2蛋白均屬于鋅指蛋白家族成員，兩者的氨基酸序列均包含4個鋅指結(jié)構(gòu)(圖3、圖4)，并且亞細(xì)胞定位預(yù)測其可能與其他物種STOPs相似，定位于細(xì)胞核中。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，柱花草SgSTOP1和SgSTOP2同屬第Ⅲ類群，所在類群包括已被證明具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能STOPs蛋白，如AtSTOP1、LjSTOP1和NtSTOP1等，它們是耐鋁毒脅迫的重要基因[13, 25]。其中，SgSTOP1與調(diào)控赤小豆(Vigna umbellata)VuSTOP1相似性最高。研究表明，VuSTOP1具有轉(zhuǎn)錄激活功能，能調(diào)控檸檬酸轉(zhuǎn)運蛋白VuMATE1的表達(dá)，從而增強赤小豆的耐鋁性[26]。SgSTOP2與高粱SbSTOP1b同源性最高。Huang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，SbSTOP1b定位于細(xì)胞核中，與SbSTOP1d形成異源二聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性功能，從而調(diào)控SbSTAR2和SbMATE的表達(dá)。此外，SgSTOP1和SgSTOP2蛋白序列與其他物種STOPs類似，均包含保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域 Motif1(圖 5)，表明 SgSTOP1和SgSTOP2是典型的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，可能具有調(diào)控下游基因表達(dá)的功能。

已有研究表明，鋁毒脅迫能夠調(diào)控植物STOPs基因的表達(dá)。如在擬南芥和大豆中，AlCl3處理后，根中AtSTOP1和GmSTOP1的表達(dá)量均顯著增加[8, 27]。在赤小豆中，Al3+和 H+均能誘導(dǎo)VuSTOP1基因的表達(dá)[26]。在高粱(Sorghum bicolor)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，AlCl3處理能誘導(dǎo)4個SbSTOP1基因的表達(dá)[22]。但是，Yamaji等[10]研究發(fā)現(xiàn)，OsART1基因表達(dá)不受Al3+影響，但 Al3+能增強OsART1下游調(diào)控基因OsSTAR1和OsSTAR2的表達(dá)，表明OsART1基因在RNA水平上不受Al3+的調(diào)控，Al3+可能在蛋白水平上影響OsART1轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。在本研究中，鋁毒脅迫顯著增強SgSTOP1在根和葉中的表達(dá)，但鋁毒脅迫對SgSTOP2在根和葉中的表達(dá)影響不明顯(圖6)，結(jié)果暗示了SgSTOP1在轉(zhuǎn)錄水平上能響應(yīng)鋁毒脅迫，而SgSTOP2可能與直系同源基因OsART1相似，在轉(zhuǎn)錄水平不受Al3+影響，其功能仍需做進(jìn)一步研究論證。

綜上所述，本研究克隆了柱花草SgSTOP1和Sg STOP2基因。亞細(xì)胞預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SgSTOP1和SgSTOP2均定位于細(xì)胞核中，兩者均為ZF-C2H2家族成員，均含有4個鋅指結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，SgSTOP1與赤小豆VuSTOP1同源性最高，SgSTOP2與高粱SbSTOP1b同源性最高。鋁毒處理顯著增強SgSTOP1基因在柱花草根和葉中的表達(dá)，暗示其參與了柱花草應(yīng)答鋁毒脅迫的過程。為此，后續(xù)研究將對SgSTOP1和SgSTOP2的亞細(xì)胞定位、基因功能，基因與柱花草耐鋁毒能力的相關(guān)性進(jìn)行深入分析，這將有助于進(jìn)一步揭示柱花草適應(yīng)鋁毒脅迫的分子調(diào)控機制。