馮育芳，邢 進(jìn)，張雪青，王 洪，李曉波，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

布魯桿菌(Brucella)為革蘭陰性的多形性球桿菌，無莢膜、鞭毛、芽孢及天然質(zhì)粒，目前主要有6個(gè)種19個(gè)生物型，其中豬、牛、羊、犬種均可感染人，是重要的人畜共患病病原之一，該菌分離培養(yǎng)困難，血清學(xué)檢測方法存在特異性差、抗原難以制備等問題，急需制定新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)?；诖?，我們建立了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)，本文對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了詳細(xì)解讀。

1 編制背景

布魯桿菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生的小球桿狀菌，可自然感染實(shí)驗(yàn)犬等動(dòng)物[1]，導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕、睪丸炎等癥狀，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)量[2]，并威脅飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員的健康[3-4]，如東北農(nóng)大就發(fā)生了布魯桿菌感染事件[5]，引起政府和社會(huì)的廣泛關(guān)注[6]。為遏制布魯桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響，確保公共衛(wèi)生安全，加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌的綜合防治和凈化工作就顯得尤為重要。歐盟實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)聯(lián)合會(huì)和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織等已將該菌列為動(dòng)物排除病原。我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國標(biāo)(GB14922.2-2001)也明確實(shí)驗(yàn)犬必需排除布魯桿菌的感染。

布魯桿菌的特異性診斷方法包括病原鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)[7-9]。其中，常用方法是血清凝集試驗(yàn)、試管凝集、及ELISA方法[10]?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 14926.45-2001)中規(guī)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測用的方法是試管凝集。而試管凝集需要使用大量的布魯桿菌抗原，該抗原的生產(chǎn)需要生物安全三級(jí)(BSL-3)及以上的特殊實(shí)驗(yàn)室和布魯桿菌菌種，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室無法獲得布魯桿菌菌種，無法自行培養(yǎng)布魯桿菌，并獲得布氏抗原[11]。以前銷售試管凝集抗原的廠家也以不再供應(yīng)該產(chǎn)品，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測遇到了無法解決的瓶頸問題[7]。為此，我們需要尋求一種更加簡便的、適用于大部分實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測方法。

為選擇合適的方法用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的布魯桿菌檢測，我們分析了國內(nèi)外動(dòng)物布魯桿菌檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[12-14]，發(fā)現(xiàn)多重PCR方法不需要培養(yǎng)活菌，大大減少了實(shí)驗(yàn)室感染的可能性，也不需要使用布氏抗原，同時(shí)可以檢測布魯桿菌的多種型別，以減少漏檢的發(fā)生，因此，多重PCR方法成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測的較為合適的方法；鑒于其實(shí)用性和廣適性，該方法也適合收錄到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，推廣供各單位參考使用。

2 法規(guī)依據(jù)

依據(jù)質(zhì)檢總局、國家標(biāo)準(zhǔn)委、民政部于2017年底發(fā)布的《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)定(試行)》的相關(guān)規(guī)定，團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)是依法成立的社會(huì)團(tuán)體為滿足市場和創(chuàng)新需要，協(xié)調(diào)相關(guān)市場主體共同制定的標(biāo)準(zhǔn)。團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的編寫參照GB/T 1.1《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》的規(guī)定執(zhí)行?！秾?shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌PCR檢測方法團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)》的制定均嚴(yán)格遵照該規(guī)定的要求執(zhí)行。

本標(biāo)準(zhǔn)收集、整理了國內(nèi)外有關(guān)組織、地方和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專業(yè)生產(chǎn)公司的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測的先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)，在研究分析質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和控制要求的異同點(diǎn)后，在我國現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量控制研究基礎(chǔ)之上制定。在確定本標(biāo)準(zhǔn)各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)，以《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量管理辦法》為依據(jù)，同時(shí)參考了國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)檢測方法》、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 細(xì)菌學(xué)檢測 染色法、培養(yǎng)基和試劑》和《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》，商檢行業(yè)推薦性標(biāo)準(zhǔn)《布氏桿菌檢疫技術(shù)規(guī)范》，以及國際公認(rèn)的具有權(quán)威性的資料如FELASA及世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)等資料，使本標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)指標(biāo)與國際水平接軌，符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，使標(biāo)準(zhǔn)具有一定的可操作性和廣適性。

3 內(nèi)容編制

3.1 適用范圍

基于感染情況調(diào)查及實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常感染牛種、豬種、犬種、羊種、綿羊種和沙林鼠種布魯桿菌。為此，本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛種、豬種、犬種、羊種、綿羊種和沙林鼠種布魯桿菌感染的動(dòng)物檢測。

3.2 檢測程序

檢測程序如圖1所示。

3.3 操作步驟

按照國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測標(biāo)本采集》，采取EDTA抗凝血、流產(chǎn)胎盤、胎膜、精液、奶、關(guān)節(jié)液和水囊瘤液等樣本。使用商品化試劑盒提取細(xì)菌DNA，菌液可直接提取，樣本需進(jìn)行研磨處理，具體提取步驟參照試劑盒使用說明。建立PCR反應(yīng)體系(見表1)，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。

如果多重PCR擴(kuò)增結(jié)果相同，則用限制性內(nèi)切酶對(duì)910 bp片段進(jìn)行組合酶切，酶切反應(yīng)體系及條件參照限制性內(nèi)切酶說明書，KpnI只能切開沙林鼠種(690)和羊種(712)，在豬型上沒有酶切位點(diǎn)；EcoRI在沙林鼠種上的酶切位點(diǎn)是458，在另兩型上有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別是豬種(450，652)，羊種(243，455)，見表2。利用組合酶切的方式可以區(qū)分沙林鼠種、豬種和羊種。

如條件允許，可將PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測序，并進(jìn)行序列比對(duì)。當(dāng)陽性對(duì)照出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)目的條帶，以及陰性空白對(duì)照無條帶時(shí)，檢測結(jié)果有效，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。待檢樣品出現(xiàn)相應(yīng)條帶時(shí)，如果難以區(qū)分是哪個(gè)種的布氏，需進(jìn)行酶切鑒定；可疑樣品PCR產(chǎn)物需送公司進(jìn)行測序；當(dāng)測序結(jié)果和PCR結(jié)果都確定為布魯桿菌時(shí)，判定為布魯桿菌陽性結(jié)果。

圖1 檢測程序Figure 1 Detection procedure

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 不同種布魯桿菌PCR產(chǎn)物(910 bp)的酶切片段

4 未來展望

布魯桿菌的檢出要求犬廠家對(duì)陽性犬進(jìn)行撲殺，基于福利倫理以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的考慮，我們判斷結(jié)果都需要慎重再慎重，所以對(duì)于陽性結(jié)果的判斷我們不能僅僅依賴一種方法，需要用其他的方法去驗(yàn)證，布魯桿菌的分子檢測方法可以有效彌補(bǔ)血清學(xué)檢測方法特異性略差的問題，對(duì)結(jié)果的判斷可以更為準(zhǔn)確，因此，該方法可以作為國標(biāo)布魯桿菌檢測方法的驗(yàn)證方法納入團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的范圍。

此外，隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的越來越高，團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化為國家標(biāo)準(zhǔn)或地方標(biāo)準(zhǔn)勢在必行，將成熟的經(jīng)實(shí)踐檢驗(yàn)過的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的國家標(biāo)準(zhǔn)，也是促進(jìn)我們的國家標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌，提高我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量整體水平的必然要求。

當(dāng)然，隨著病原檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)也將在未來的實(shí)施和實(shí)踐中也會(huì)不斷的改進(jìn)和提高；特別是，其他領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)及國際標(biāo)準(zhǔn)中的布魯桿菌診斷方法要比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的布魯桿菌的檢測方法全面，我們也需要不斷的補(bǔ)充完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物布魯桿菌檢測方法和檢測標(biāo)準(zhǔn)，努力提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，從而保障藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)和人民群眾的身體健康。