李朝英,鄭 路,2*,楊文娟,莫世宇

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心,廣西 憑祥 532600;2.廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站,廣西 憑祥 532600)

0 引言

木質(zhì)素是自然界中唯一可提供再生性芳香基化合物的非石油類資源,是僅次于纖維素的第二大類可再生生物質(zhì)資源,可作為獲取潔凈能源和高附加值化學(xué)品的原料。木質(zhì)素含量及其相關(guān)酶系活性與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗病性、抗逆性密切相關(guān);在造紙工業(yè)中,木質(zhì)素處理是造成環(huán)境污染的重要來源[1-2]。因此,木質(zhì)素的定量分析有著重要意義。應(yīng)用紅外光譜是檢測(cè)木質(zhì)素的現(xiàn)代方法,但儀器昂貴,應(yīng)用有限[3-4]。在20世紀(jì)60年代, Van Soest P J提出的范氏法是國(guó)際上被廣泛應(yīng)用的經(jīng)典方法,國(guó)內(nèi)依此方法建立了飼料、谷物木質(zhì)素的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。范氏法中的樣品經(jīng)酸性洗滌劑消煮后得到酸性洗滌纖維(ADF)，再加入硫酸水解纖維素,所得殘?jiān)一蟮氖Ｓ辔餅樗岵蝗芑曳?AIA),通過殘?jiān)cAIA的差重得出酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)的含量[5-7]。在20世紀(jì)80年代,國(guó)內(nèi)提出了王玉萬法,樣品經(jīng)中性洗滌劑、鹽酸沸水浴處理,其后測(cè)定操作與范氏法相似。用這兩種方法測(cè)定農(nóng)副產(chǎn)品樣品ADL的比較分析研究有一些,但目前對(duì)用范氏法測(cè)定植物樣品(尤其是針闊葉、草本植物)ADL的影響因素的報(bào)道甚少,用范氏法與王玉萬法測(cè)定多類植物ADL的比較分析報(bào)道較為少見[8]。為此,本實(shí)驗(yàn)以針闊葉、竹類及一年生草本植物為樣品,對(duì)范氏法不同消煮時(shí)間、不同硫酸濃度以及酸浸泡不同時(shí)間的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較分析,探討了影響范氏法測(cè)定結(jié)果的主要因素；對(duì)人工檢測(cè)、儀器法進(jìn)行了比較,探尋了人工檢測(cè)、儀器法測(cè)定結(jié)果的差異；此外還對(duì)范氏法與王玉萬法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較討論,以期為實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)確測(cè)定植物木質(zhì)素提供可行的參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試劑及儀器

硫酸、丙酮、十六烷三甲基溴化銨、酸性洗滌劑(將20 g十六烷三甲基溴化銨溶于1000 mL的0.5 mol/L硫酸中)、中性洗滌劑(將18.6 g乙二胺四乙酸二鈉和6.8 g硼酸溶于少量水中,再加入含有30 g十二烷基硫酸鈉、 10 mL乙二醇乙醚、4.56 g無水磷酸氫二鈉的溶液,定容至1000 mL)、十氫化萘,以上試劑均為分析純級(jí)別或自行配制。

電子分析天平(1/100000)、石墨加熱板、真空泵、馬弗爐、烘箱、Fibertec 8000纖維素分析儀、高壓鍋。

1.2 樣品采集與處理

2016年6月于廣西友誼關(guān)森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站設(shè)置在熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心伏波實(shí)驗(yàn)場(chǎng)的樣地中采集30年生馬尾松(Pinusmassoniana)人工林內(nèi)的馬尾松側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱馬枝)、2年生桉樹(Eucalyptusrobusta)人工林內(nèi)的桉樹側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱桉枝)、佛肚竹(Bambusaventricosa)側(cè)枝(以下簡(jiǎn)稱竹枝)以及在林緣生長(zhǎng)的鬼針草(Bidenspilosa)全株(以下簡(jiǎn)稱草株)。將各植物樣品在干燥箱(65 ℃)中烘干后粉碎，過40目(粒徑≤0.5 mm)篩,并裝袋標(biāo)識(shí)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 范氏法 稱取樣品0.5000 g,加入50 mL酸性洗滌劑,再加入5滴十氫化萘,在瓶口加漏斗,在漏斗中加放玻璃珠,迅速煮沸后保持小沸一定時(shí)間,趁熱倒入已知重量W0的2G砂芯坩堝抽濾,并用熱水沖洗殘?jiān)翞V液無泡沫且呈中性；用10 mL丙酮沖洗殘?jiān)翞V液呈無色,抽凈丙酮并烘干稱重得W1；加入5 mL的72%硫酸,充分浸沒樣品，待硫酸滲濾完畢時(shí)及時(shí)補(bǔ)加；在室溫下放置3 h后,用熱水沖洗到中性,將殘?jiān)?05 ℃烘箱中烘干稱重得W2。將殘?jiān)庞?50 ℃馬弗爐中灰化3 h后,稱重得W3。相關(guān)計(jì)算公式為：酸性洗滌纖維(ADF)含量(%)=(W1-W0)/0.5×100%;硫酸處理殘?jiān)?%)=(W2-W0)/0.5×100%;酸性洗滌木質(zhì)素 (ADL)含量(%)=(W2-W3)/0.5×100%。

按上述方法進(jìn)行操作,在其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)固定的條件下，消煮時(shí)間分別設(shè)為15、30、60 min，所加硫酸的質(zhì)量濃度分別設(shè)為65%、70%、72%、75%、78%，靜置時(shí)間分別設(shè)為1.5、3.0、4.0、5.5、8.0 h。

1.3.2 儀器法 稱取樣品,以Fibertec 8000纖維素分析儀按1.3.1操作,各實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置同上。

1.3.3 王玉萬法 稱取樣品0.5000 g,加入50 mL中性洗滌劑,在100 ℃高壓鍋保溫1 h,以2號(hào)砂芯漏斗過濾至濾液呈中性,用丙酮洗滌殘?jiān)鼉纱?；將殘?jiān)D(zhuǎn)移到50 mL比色管中,加入50 mL的2 mol/L鹽酸溶液,在100 ℃高壓鍋保溫50 min,以2G砂芯坩堝過濾至濾渣呈中性,用丙酮洗2次,加入72%濃硫酸5 mL,常溫水解3 h,再加水45 mL,在室溫下過夜；之后烘干、稱重、灰化操作同1.3.1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及繪圖,使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 消煮時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

由表1可見,用酸性洗滌劑消煮樣品15、30、60 min所測(cè)定的ADF呈現(xiàn)降低趨勢(shì),用硫酸處理后殘?jiān)癆DL趨于一致。這說明隨著樣品消煮時(shí)間延長(zhǎng),樣品組織中多糖物質(zhì)被不斷溶解,ADF中殘留的多糖物質(zhì)減少,所測(cè)ADF隨之降低。在加入硫酸后,ADF中殘留的多糖物質(zhì)及其中的纖維素被硫酸水解完全,故硫酸處理后殘?jiān)呌谝恢?由ADL=硫酸處理后殘?jiān)?AIA可知,所測(cè)ADL趨于一致。樣品經(jīng)不同時(shí)間消煮后所測(cè)ADL的SD在0.07～1.78之間,離散度小,精密度良好。

經(jīng)方差分析,消煮15 min與30 min、60 min所測(cè)定的ADF有顯著性差異,硫酸處理后殘?jiān)癆DL無顯著性差異?？梢?酸性洗滌劑消煮時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)ADF測(cè)定有影響；由于硫酸可充分水解ADF中的多糖及纖維素,因此消煮時(shí)間對(duì)ADL的測(cè)定影響不明顯。但考慮到洗滌劑充分浸潤(rùn)植物組織,有利于硫酸的滲透,保證組織致密或易飄浮的植物顆粒水解反應(yīng)完全,本實(shí)驗(yàn)提出消煮30 min為宜。

2.2 硫酸濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

由圖1可見：隨硫酸濃度升高所測(cè)ADL呈減小趨勢(shì)；65%硫酸所測(cè)ADL偏高；竹枝以70%、72%、75%硫酸所測(cè)結(jié)果穩(wěn)定一致；馬枝、桉枝及草株以70%、72%、75%硫酸所測(cè)結(jié)果呈緩慢下降趨勢(shì)；各樣品以78%硫酸所測(cè)結(jié)果均持續(xù)下降,其中桉枝和草株所測(cè)結(jié)果降幅明顯。這是因?yàn)?5%硫酸的濃度偏低,ADF中多糖類物質(zhì)及纖維素水解不充分,ADL偏高;78%硫酸的濃度偏高,在充分水解多糖及纖維素的同時(shí),破壞了木質(zhì)素結(jié)構(gòu),使ADL偏低。這說明70%～75%硫酸有利于將植物樣品中多糖類物質(zhì)及纖維素水解充分,且不易破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)。

表1 不同消煮時(shí)間的測(cè)定結(jié)果

注:表中測(cè)定結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。以消煮15 min所測(cè)定的ADF為對(duì)照組,消煮30 min、60 min所測(cè)定的ADF與其相比,同行間無字母的無顯著性差異,后標(biāo)字母a的有顯著性差異(P<0.05)。以消煮15 min所測(cè)定的硫酸處理后殘?jiān)鼮閷?duì)照組,消煮30 min、60 min所測(cè)定的殘?jiān)c其相比,同行間無字母的無顯著性差異,后標(biāo)字母b的有顯著性差異(P<0.05)。以消煮15 min所測(cè)定的ADL為對(duì)照組,消煮30 min、60 min所測(cè)定的ADL與其相比,同行間無字母的無顯著性差異,后標(biāo)字母c的有顯著性差異(P<0.05)。

由表2可以看出：70%、75%硫酸所測(cè)ADL有顯著性差異；70%、72%硫酸所測(cè)ADL無顯著性差異；72%、75%硫酸所測(cè)ADL無顯著性差異；用70%、72%、75%硫酸所測(cè)ADL的CV分別為2.75%～8.03%、2.32%～6.66%、2.62%～6.74%，說明用72%～75%硫酸所測(cè)ADL的CV相當(dāng),優(yōu)于用70%硫酸所測(cè)的。因此,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選硫酸濃度為72%～75%。以下實(shí)驗(yàn)選擇72%的硫酸。

2.3 硫酸浸泡樣品不同時(shí)間對(duì)ADL測(cè)定的影響

由圖2可見:所測(cè)樣品ADL隨著硫酸浸泡樣品時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；浸泡1.5 h所測(cè)ADL偏高；浸泡3.0～4.0 h所測(cè)ADL趨于穩(wěn)定一致;浸泡5.5 h,竹枝ADL有明顯降幅;浸泡8.0 h,各樣品的ADL均有明顯降幅。說明浸泡1.5 h,樣品中多糖類物質(zhì)及纖維素未被硫酸水解充分；浸泡3.0～4.0 h,樣品中多糖類物質(zhì)及纖維素水解充分,所測(cè)ADL趨于穩(wěn)定；浸泡5.5 h、8.0 h,所測(cè)ADL趨于不穩(wěn)定。因此,本實(shí)驗(yàn)提出硫酸浸泡3.0～4.0 h為宜。

圖1 用不同濃度硫酸所測(cè)定的ADL

樣品ADL/%70%硫酸72%硫酸75%硫酸CV/%70%硫酸72%硫酸75%硫酸馬枝38.76±1.2837.76±0.8636.59±0.97 a3.302.322.62竹枝14.19±0.3914.72±0.9815.09±0.762.756.665.04桉枝19.85±1.5419.38±1.0918.11±1.228.035.626.74草株18.33±0.9917.82±0.9116.52±1.06 a5.405.116.42

注:測(cè)定結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。以70%硫酸所測(cè)ADL為對(duì)照組,72%、75%硫酸所測(cè)ADL與其相比,同行間無字母的無顯著性差異,后標(biāo)字母a的有顯著性差異(P<0.05)。以72%硫酸所測(cè)ADL為對(duì)照組,70%、75%硫酸所測(cè)ADL與其相比,同行間無字母的無顯著性差異,后標(biāo)字母b的有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 范氏法人工檢測(cè)、儀器法與王玉萬法測(cè)定結(jié)果的比較

由表3可見：范氏法人工檢測(cè)所測(cè)ADL的CV在2.32%～6.66%之間；儀器法所測(cè)ADL的CV在0.32%～1.10%之間。因此范氏法人工檢測(cè)ADL的精密度低于儀器法的，說明人工檢測(cè)中的樣品消煮、轉(zhuǎn)移、抽濾過程易造成樣品損失,檢測(cè)誤差大，而儀器法中的樣品消煮、酸浸泡及抽濾清洗等操作均在坩堝中進(jìn)行,樣品無需轉(zhuǎn)移,避免了樣品損失,誤差小。

由表3還可以看出,王玉萬法所測(cè)ADL的CV在2.31%～5.19%之間,其精密度略高于范氏法人工檢測(cè)的。這是因?yàn)橥跤袢f法中的樣品以保溫處理,不回流消煮,避免了一些誤差。王玉萬法加硫酸靜置3 h后,加水以稀酸浸泡樣品過夜,不同于范氏法,這有利于殘留多糖或纖維素進(jìn)一步水解,從而降低了誤差。

經(jīng)方差分析,范氏法人工檢測(cè)與儀器法所測(cè)ADL無顯著性差異,范氏法人工檢測(cè)與王玉萬法所測(cè)ADL無顯著性差異。可見,范氏法與王玉萬法檢測(cè)系統(tǒng)中所用洗滌劑不同,樣品處理?xiàng)l件不同,但兩種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致。

表3 范氏法人工檢測(cè)、儀器法與王玉萬法的測(cè)定結(jié)果

注:測(cè)定結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。以人工檢測(cè)結(jié)果為對(duì)照組,儀器法和王玉萬法所測(cè)結(jié)果與其相比,同行間無字母的無顯著性差異。

圖2 濃硫酸處理樣品不同時(shí)間的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：消煮時(shí)間對(duì)ADL測(cè)定影響不明顯；硫酸濃度及浸泡時(shí)間對(duì)ADL的測(cè)定有一定影響；用酸性洗滌劑消煮30 min,用72%～75%硫酸浸泡樣品3～4 h,可充分水解植物細(xì)胞壁中的果膠、蛋白、半纖維素、纖維素,清除ADL測(cè)定干擾物,保證ADL的準(zhǔn)確測(cè)定；范氏法人工檢測(cè)與儀器法所測(cè)ADL無顯著性差異,人工檢測(cè)易存在人為偏差,其所測(cè)結(jié)果的精密度低于儀器法的[9-10]；范氏法與王玉萬法所測(cè)針闊葉、草本植物樣品的ADL無顯著性差異,這兩種方法有較好的可比性。

4 討論

范氏法對(duì)樣品消煮1 h,再用72%硫酸浸泡3 h。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)植物樣品經(jīng)酸性洗滌劑消煮30 min,再用72%～75%硫酸浸泡3～4 h時(shí),所測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)所述檢測(cè)條件較原方法有較強(qiáng)的可操作性。為了保證檢測(cè)結(jié)果的可比性,建議同批量樣品檢測(cè)所用硫酸濃度及浸泡時(shí)間應(yīng)保持恒定。

木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜,有資料認(rèn)為多年生的針闊葉不適合用范氏法測(cè)定ADL,目前有關(guān)用不同方法測(cè)定不同類型植物樣品木質(zhì)素的分析討論甚少[3,11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用范氏法與王玉萬法測(cè)定針闊葉、草本植物樣品的ADL，這兩種方法的測(cè)定結(jié)果趨于一致,有較強(qiáng)的可比性。這表明用兩種方法測(cè)定針闊葉、草本植物的ADL有一定的適用性。