張成東，曲久燕*，李德喜，郭海巖，劉夢(mèng)龍，崔松濤

(1.河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司 豬藥市場(chǎng)部，河南 鄭州 450000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000)

β-內(nèi)酰胺類抗生素是醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)上使用最早、用量最大的一類抗生素，隨著第三代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，臨床上也出現(xiàn)了不同程度的耐藥菌[1]。細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)破壞β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而產(chǎn)生耐藥性。近年來(lái)，由于各種廣譜及超廣譜藥物的廣泛應(yīng)用，尤其是不合理應(yīng)用，使致病菌對(duì)抗生素的耐藥性急劇上升，多重耐藥菌株不斷增多[2]，從而影響了藥物的使用。

ESBLs耐藥基因包括CTX-M、TEM、SHV和OXA等[3]，這些基因常定位于質(zhì)粒上，易于擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，加速耐藥基因的傳播。

大腸桿菌是人畜腸道共棲菌和條件性致病菌[4-5]，也是產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶的代表菌之一。目前對(duì)河南省動(dòng)物源大腸桿菌ESBLs基因研究較多[6-12]，但對(duì)豬源大腸桿菌ESBLs基因的系統(tǒng)研究相對(duì)較少，不能充分代表河南豬源大腸桿菌ESBLs耐藥基因流行情況。因此，本研究從河南6個(gè)地區(qū)的10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)入手，旨在更客觀地了解豬源性大腸桿菌的ESBLs基因的流行情況及基因型分布情況，不僅可為大腸桿菌相關(guān)疾病防控提供科學(xué)依據(jù)，而且可為豬場(chǎng)獸醫(yī)臨床合理用藥提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣對(duì)象 2018年8月從豫東(蘭考縣、曹縣)、豫北(輝縣、淇縣)、豫西(博愛縣、沁陽(yáng)市、宜陽(yáng)縣)、豫南(遂平縣、西平縣)6個(gè)地市9個(gè)縣的10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)(母豬存欄300～2000頭)取母豬直腸分泌物436份、哺乳仔豬直腸分泌物425份。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。

1.1.3 培養(yǎng)基 腦心浸液肉湯(BHI)、麥康凱瓊脂購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司，ECC購(gòu)自博賽科瑪嘉。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離培養(yǎng) 用滅菌棉棒采豬直腸拭子置入5 mL采樣轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中，分別取一環(huán)菌液劃線于麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行大腸桿菌的初篩分離，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，選取粉紅色菌落，接種到ECC平板，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行純化。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank公布的ESBLs基因序列，參照文獻(xiàn)[13]和[14]的合成引物，引物由蘇州鴻訊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 DNA模板提取 采用煮沸法提取菌株DNA模板。挑取過(guò)夜培養(yǎng)后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌落調(diào)入含500 μL無(wú)菌生理鹽水的1.5 mL離心管內(nèi)，充分混勻，放入100 ℃沸水浴中煮沸15 min。10000 r/min離心30 s后，吸取上清液即為擴(kuò)增模板。從平板挑取疑似大腸桿菌單克隆于2 mL LB肉湯中，37 ℃恒溫?fù)u床200 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(約12 h)。菌液離心富集后，加入滅菌的蒸餾水100 μL重懸沉淀。100 ℃煮沸30 min，取出后立即冰浴10 min。12000 r/min離心3 min，取80 μL上清作為PCR模板，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ESBLs菌基因的PCR檢測(cè) 各目的基因片段擴(kuò)增體系均為20 μL，反應(yīng)所用的試劑和擴(kuò)增程序見表1，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 PCR擴(kuò)增體系及其擴(kuò)增程序

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離情況

河南省6個(gè)地區(qū)10個(gè)豬場(chǎng)861份(母豬436份，哺乳仔豬425份)直腸分泌物中共分離出704株大腸桿菌(圖1、圖2)，分離率為81.77%；其中母豬分離出419株大腸桿菌，檢出率為96.10%；哺乳仔豬分離出285株，檢出率為67.06%。

圖1 大腸桿菌麥康凱培養(yǎng)基分離

2.2 ESBLs 菌耐藥基因檢測(cè)及分析

對(duì)704株大腸桿菌用8對(duì)ESBLs基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，共從580株菌中檢測(cè)出ESBLs基因(表2)，檢出率為82.39%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分別檢出552、231、173和18株，檢出率分別為78.41%、32.81%、24.57%和2.56%；檢測(cè)到1種耐藥基因的ESBLs菌284株，占總檢測(cè)菌株的40.34%；檢測(cè)到2種及以上耐藥基因的ESBLs菌296株，占總檢測(cè)菌株的42.05%(其中2種耐藥基因203株、3種耐藥基因88株、4種耐藥基因5株，分別占總檢測(cè)菌株的28.84%、12.50%、0.71%)；TEM+CTX-M基因型ESBLs菌224株，占總檢測(cè)菌株的31.82%；TEM+OXA+CTX-M基因型ESBLs菌82株，占總檢測(cè)菌株的11.65%；TEM+SHV+OXA+CTX-M基因型ESBLs菌5株，占總檢測(cè)菌株的0.71%。由PCR檢測(cè)結(jié)果可知，河南省規(guī)?；i場(chǎng)ESBLs菌陽(yáng)性率高達(dá)82.39%，CTX-M、TEM和OXA是引起ESBLs耐藥的主要基因，表明河南規(guī)模化豬場(chǎng)廣泛存在耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的大腸桿菌。部分陽(yáng)性菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段電泳陽(yáng)性圖見圖3。

圖2 大腸桿菌科瑪嘉ECC培養(yǎng)基鑒定

2.3 母豬ESBLs菌耐藥基因檢測(cè)及分析

對(duì)母豬樣本分離出的419株大腸桿菌進(jìn)行ESBLs基因PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示:共從336株菌中檢測(cè)出ESBLs基因，檢出率為80.19%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分別檢出322、144、61和7株，檢出率分別為76.85%、34.37%、14.56%和1.67%；檢測(cè)到1種耐藥基因的ESBLs菌180株，占總檢測(cè)菌株的42.96%；檢測(cè)到2種及以上耐藥基因的ESBLs菌156株，占總檢測(cè)菌株的37.23%(其中2種耐藥基因117株、3種耐藥基因36株、4種耐藥基因3株，分別占總檢測(cè)菌株的27.92%、8.59%、0.72%)；CTX-M+TEM基因型ESBLs菌138株，占總檢測(cè)菌株的32.94%；CTX-M+TEM+OXA基因型ESBLs菌37株，占總檢測(cè)菌株的8.83%；CTX-M+TEM+OXA+SHV基因型ESBLs菌3株，占總檢測(cè)菌株的0.72%。由PCR檢測(cè)結(jié)果可知，河南省規(guī)?；i場(chǎng)母豬ESBLs菌陽(yáng)性率高達(dá)80.19%，CTX-M和TEM是引起ESBLs耐藥的主要基因。

表2 河南省規(guī)?；i場(chǎng)ESBLs基因PCR檢測(cè)情況

1.CTX-M-2，2.CTX-M-9，3.TEM，4.OXA，5.SHV

2.4 仔豬ESBLs菌耐藥基因檢測(cè)及分析

對(duì)哺乳仔豬樣本分離出的285株大腸桿菌進(jìn)行ESBLs基因PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，共從244株菌中檢測(cè)出ESBLs基因(表4)，檢出率為85.61%，其中CTX-M、TEM、OXA和SHV基因分別檢出230、87、112和11株，檢出率分別為80.70%、30.53%、39.30%和3.86%；檢測(cè)到1種耐藥基因的ESBLs菌104株，占總檢測(cè)菌株的36.49%；檢測(cè)到2種及以上耐藥基因的ESBLs菌140株，占總檢測(cè)菌株的49.12%(其中2種耐藥基因86株、3種耐藥基因52株、4種耐藥基因2株，分別占總檢測(cè)菌株的30.18%、18.25%、0.70%)；CTX-M+TEM基因型ESBLs菌86株，占總檢測(cè)菌株的30.18%；CTX-M+OXA基因型ESBLs菌98株，占總檢測(cè)菌株的34.39%；CTX-M+TEM+OXA基因型ESBLs菌45株，占總檢測(cè)菌株的15.79%；CTX-M+TEM+OXA+SHV基因型ESBLs菌2株，占總檢測(cè)菌株的0.70%。由PCR檢測(cè)結(jié)果可知，河南省規(guī)?；i場(chǎng)哺乳仔豬ESBLs菌陽(yáng)性率高達(dá)85.61%，CTX-M、OXA和TEM是引起ESBLs耐藥的主要基因,哺乳仔豬ESBLs菌耐藥基因攜帶情況比母豬更復(fù)雜。

表3 河南省規(guī)模化豬場(chǎng)母豬ESBLs基因PCR檢測(cè)情況

2.5 不同豬場(chǎng)ESBLs菌耐藥基因檢測(cè)及分析

在河南省10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)分離的大腸桿菌中(圖4)，1場(chǎng)(樣本量：母豬30+哺乳仔豬29)和2場(chǎng)(樣本量：母豬21+哺乳仔豬24)ESBLs菌的檢出率最高，均為100%；其次是5場(chǎng)和6場(chǎng)的檢出率為94%以上，7場(chǎng)、10場(chǎng)和4場(chǎng)的檢出率為80%以上，8場(chǎng)的檢出率最低，為54.55%。豫東地區(qū)的1場(chǎng)和2場(chǎng)耐藥基因型最復(fù)雜，CTX-M、TEM、OXA基因檢出率分別為96.61%、100%、74.58%和100%、95.65%、57.78%，其中1場(chǎng)ESBLs菌耐藥基因型最多，同時(shí)攜帶CTX-M、TEM、OXA和SHV基因型的菌株檢出率為8.47%，其余各場(chǎng)不存在同時(shí)攜帶4種基因型的菌株；豫北地區(qū)的3場(chǎng)耐藥基因最單一，僅CTX-M基因的檢出率最高，為71.03%；豫南地區(qū)的8場(chǎng)、9場(chǎng)和10場(chǎng)，OXA基因的檢出率高于TEM基因，其他豬場(chǎng)TEM基因的檢出率大于OXA基因檢出率。

表4 河南省規(guī)模化豬場(chǎng)哺乳仔豬ESBLs基因PCR檢測(cè)情況

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示，河南省豫東、豫西、豫南、豫北10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)分離的704株大腸桿菌，耐藥基因檢測(cè)ESBLs菌檢出率為82.39%(580/704)，高于2009年河南地區(qū)報(bào)道的78.26%(36/46)[8]和2015年閩西地區(qū)報(bào)道的28.6%[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶1種耐藥基因ESBLs菌284株，占總檢測(cè)菌株的40.34%，同時(shí)攜帶2種及以上耐藥基因的ESBLs菌296株，占總檢測(cè)菌株的42.05%，說(shuō)明了河南省產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥基因更為復(fù)雜，規(guī)?；i場(chǎng)廣泛存在耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的大腸桿菌，河南省ESBLs菌耐藥現(xiàn)狀及變化趨勢(shì)不容樂觀。

有報(bào)道表明，不同國(guó)家和地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的基因型存在一定差異[1，15-17]，我國(guó)大陸主要為CTX-M和SHV基因型，與本研究有一定差異。本研究顯示，704株大腸桿菌的CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、TEM、OXA和SHV8種基因亞型的檢出率分別為0、38.35%、0、69.89%、0、32.81%、24.57%和2.56%，顯示河南省豬源ESBLs大腸桿菌主要為CTX-M型，TEM型和OXA型次之，SHV型最少，與江西地區(qū)較為相似[18]。豫東地區(qū)豬場(chǎng)耐藥基因型最復(fù)雜，主要為CTX-M、TEM、OXA三種基因型，豫北和豫西地區(qū)，主要為CTX-M和TEM兩種基因型，與貴州地區(qū)較為接近[19]；豫南地區(qū)主要為CTX-M和OXA兩種基因型。本研究發(fā)現(xiàn)，母豬群ESBLs大腸桿菌中，TEM基因型檢出率(34.37%)大于OXA基因型檢出率(14.56%)，而在哺乳仔豬群中，OXA基因型檢出率(39.30%)大于TEM基因型檢出率(30.53%)；其中豫南地區(qū)3個(gè)豬場(chǎng)OXA基因型檢出率較高，且哺乳仔豬與母豬OXA基因型檢出率差異較大，母豬OXA基因型檢出率分別為44.44%(4/9)、1.92%(1/52)、18.33%(11/60),哺乳仔豬OXA基因型檢出率分別為46.15%(6/13)、60.42%(29/48)、39.53%(17/43)。不同地區(qū)以及同一地區(qū)不同日齡豬群，產(chǎn)ESBLs大腸桿菌基因型存在差異，可能與不同地區(qū)以及同一地區(qū)不同日齡豬群使用的抗菌藥不同有關(guān)[20]。不同基因型產(chǎn)ESBLs菌株間的耐藥性差異需要進(jìn)一步研究。

圖4 河南省10個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)ESBLs菌耐藥基因PCR檢測(cè)情況

獸醫(yī)臨床上抗菌藥的不合理使用，正在誘導(dǎo)、加劇多重耐藥菌的出現(xiàn)，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類自身健康。豬場(chǎng)應(yīng)該在獸醫(yī)的指導(dǎo)下，依據(jù)診斷結(jié)果合理選擇敏感的抗生素進(jìn)行疾病防治，避免抗生素的不合理使用加劇耐藥菌的出現(xiàn)。本研究表明，河南省規(guī)?；i場(chǎng)廣泛存在耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的大腸桿菌，且比2009年更加嚴(yán)重，提示我們?cè)谂R床上需要選擇更加敏感的抗生素進(jìn)行ESBLS菌引起的疾病防治。