王彬輝，鄒 杰，章文紅，李范珠，高曉宇，陳 玲，郭曼曼，葉曉莉*

0 引言

姜黃素(Curcumin,Cur)是一種多酚類化合物[1]，研究發(fā)現(xiàn)，其抑制肝腫瘤細(xì)胞是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡、改變細(xì)胞受體連接等實(shí)現(xiàn)的[2-3]。然而，姜黃素在水中溶解度極低，且姜黃素的濃度越高對(duì)細(xì)胞的毒性越大，藥物在體內(nèi)代謝迅速，故限制了姜黃素的臨床應(yīng)用[4]。

納米粒具有靶向作用，可提高藥物的溶解度、延長藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間等特點(diǎn)[5-7]。本實(shí)驗(yàn)以姜黃素為模型藥物，以聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PEG-PCL)為載體材料，通過正交實(shí)驗(yàn)篩選最佳處方工藝，制備具有肝靶向的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒，為構(gòu)建姜黃素納米粒的載藥系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本Jeol公司)；Optima超速低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)；Mill-Q超純水器(美國Millpore公司)；Nano-ZS型粒徑分析儀(英國Malvern公司)；HJ-6B多頭磁力加熱攪拌機(jī)(金壇市金偉實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

姜黃素對(duì)照品(含量98.8%，批號(hào)：110823-201004，中國食品藥品檢定研究院)；姜黃素原料藥(含量>98%，批號(hào)：12041502，成都普思生物技術(shù)有限公司)；甲醇(色譜醇，德國Merck公司)、乙腈(色譜醇，德國Merck公司)；聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(山東岱罡生物科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素含量測定

2.1.1 姜黃素對(duì)照品溶液的制備 取姜黃素對(duì)照品10.00 mg，甲醇溶解，并定容到100 ml，作為姜黃素對(duì)照品溶液。

2.1.2 色譜條件[8]色譜柱：Thermo Hypersil Gold(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：2%醋酸-乙腈(46∶54)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：260 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.1.3 專屬性考察 取姜黃素對(duì)照品溶液、空白聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒和姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒，考察其專屬性，結(jié)果見圖1，色譜峰專一、靈敏，且峰形良好，姜黃素的保留時(shí)間約為11.3 min。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取姜黃素對(duì)照品溶液，制備系列濃度的姜黃素樣品溶液50.00、20.00、10.00、5.00、2.00、1.00 μg/ml，用HPLC測定，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=42.31X-26.61，r=1(n=6)。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度分別為4.97、9.97、19.81 μg/ml的姜黃素對(duì)照品溶液，同一天內(nèi)用HPLC測6次，日內(nèi)精密度RSD符合要求(<2%)。

2.1.6 方法回收率試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度為16.00、20.00、24.00 μg/ml的含處方量輔料的姜黃素溶液，測定方法回收率。結(jié)果見表1。

表1 方法回收率(n=6)

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度為20.00 μg/ml的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒樣品溶液，考察樣品穩(wěn)定性(12 h內(nèi))，結(jié)果顯示，RSD為0.75%，表明姜黃素在12 h內(nèi)測定穩(wěn)定。

2.2 姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的制備 有機(jī)相(A相)：取姜黃素和聚乙二醇-聚己內(nèi)酯，溶于二氯甲烷與乙酸乙酯的混合溶劑中；水相(A相)：取泊洛沙姆188，溶于水中。把A相與B相混合，超聲，制得初乳；再制備一份泊洛沙姆188的水溶液，把初乳滴加此水溶液中，繼續(xù)攪拌直到揮去有機(jī)溶劑和部分水，得到姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒溶液，此溶液呈黃色乳光。

2.3 指標(biāo)考察

2.3.1 形態(tài)學(xué)考察[9]常溫下，取一定量的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒，滴于銅網(wǎng)上，用濾紙吸干溶液，再把質(zhì)量濃度為2.0%的磷鎢酸溶液滴于銅網(wǎng)上，等自然揮干后，觀察納米粒的形態(tài)。

2.3.2 納米粒粒徑測定 制備姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒溶液，加入到樣品池中，用粒徑分析儀測定，記錄數(shù)據(jù)。

2.3.3 納米粒包封率與載藥量測定 精密量取一定量的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒溶液，置于離心管中，封口，低溫超速離心(40 000 r/min，45 min)后，取上清液，微孔濾膜(0.22 μm)濾過，稱重，記W1。取姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒溶液1 ml，甲醇定容至10 ml，微孔濾膜(0.22 μm)濾過，計(jì)算1 ml姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒溶液中的藥物總含量，記W0。聚乙二醇-聚己內(nèi)酯和姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒中姜黃素的質(zhì)量之和，記Wt。包封率=(W0-W1)/W0×100%，載藥量=(W0-W1)/Wt×100%。

2.4 姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒最佳處方工藝 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，共選擇4個(gè)因素：因素A為有機(jī)相與內(nèi)水相體積比、因素B為乙酸乙酯與二氯甲烷體積比、因素C為內(nèi)水相表面活性劑濃度、因素D為聚乙二醇-聚己內(nèi)酯用量，按L9(34)正交試驗(yàn)，篩選處方工藝。

2.5 體外釋放度測定 采用動(dòng)態(tài)透析袋法考察姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的體外釋藥特性，釋放介質(zhì)為含有20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)。分別稱3份含1 mg姜黃素的姜黃素對(duì)照品和姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒，用2 ml 20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)釋放介質(zhì)溶解，得到的溶液置于預(yù)先處理過的透析袋(Mw=3 500)中，再把透析液放入250 ml 20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)的釋放介質(zhì)內(nèi)，(37±0.5)℃水浴振蕩(振蕩速度75 r/min)，按一定時(shí)間點(diǎn)各取樣1 ml，取樣后立即補(bǔ)加1 ml的20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)釋放介質(zhì)，微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液測含量，計(jì)算累積釋藥率(Q%)。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn) 把粒徑、包封率和載藥量3個(gè)指標(biāo)按系數(shù)積分分配數(shù)值：粒徑(F1)的系數(shù)積分為30%、包封率(F2)的系數(shù)積分為35%、載藥量(F3)的系數(shù)積分為35%。綜合評(píng)分值(F)=F2/91.33×30+(1-F1/163.4)×35+F3/5.49×35。結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表4 方差分析

由表3可知，D因素對(duì)納米粒的制備影響最大，其次分別為C和A，而B因素的影響最小。由表4可知，因素C、因素D顯著影響姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的制備。根據(jù)表3和表4，確定了姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的最佳處方工藝為A3B1C1D2。

3.2 最佳工藝驗(yàn)證 按正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳處方工藝制備3批納米粒，測粒徑、多分散系數(shù)、包封率、Zeta電位和載藥量，結(jié)果顯示，粒徑為(102.84±2.68)nm，多分散系數(shù)為0.11±0.01、包封率為84.36%±1.19%，Zeta電位為(-0.29±0.11)mV，載藥量為4.70%±0.27%。見表5。姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒呈圓形或類圓形，粒子間未見黏連，結(jié)果見圖2～圖4。

表5 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

圖2 姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒透射電鏡照片

圖3 姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒粒徑分布

圖4 姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒Zeta電位

3.3 體外釋放試驗(yàn)結(jié)果 在20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)的釋放介質(zhì)中，釋藥曲線見圖5，結(jié)果顯示，2 h累積釋藥超過80%，表明姜黃素原藥在20%乙醇的PBS溶液(pH 5.8)的釋放介質(zhì)中釋藥較快。而姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的體外釋放緩慢：2 h累積釋藥不足35%，10 h累積釋藥70%左右，直到48 h累積釋藥超過85%。根據(jù)藥物體外釋放模型，擬合釋藥行為，結(jié)果分別為：Higuchi模型=14.472t1/2+12.343(r=0.925 7)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型ln(1-Q)=-0.046 3t+4.208 8(r=0.870 1)、零級(jí)模型Q=1.752 2t+31.219(r=0.772 5)、Weibull模型lnln(1/1-Q)=0.727 5 lnt-1.439 5(r=0.994 0)，表明姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒在釋放介質(zhì)中釋藥行為符合Weibull方程。

圖5 姜黃素溶液和姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒釋放曲線(n=3)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用乳化溶劑揮發(fā)法[10]制備了姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒，預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾選擇有機(jī)相為丙酮、丙酮與乙醇的混合溶劑，但制備得到的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒粒徑、多分散系數(shù)、包封率均較小；當(dāng)選擇有機(jī)相為二氯甲烷、丙酮與二氯甲烷的混合溶劑時(shí)，制備得到的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒粒徑、多分散系數(shù)均較大，也不合適。選擇有機(jī)相為二氯甲烷與乙酸乙酯的混合溶劑時(shí)，制備得到的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒包封率、載藥量都較高，且較穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇二氯甲烷與乙酸乙酯的混合溶劑為有機(jī)相。

因聚己內(nèi)酯在體內(nèi)具有良好的生物細(xì)胞相容性和降解性，常用作緩控釋制劑的載體[11-12]，但聚己內(nèi)酯親水性較弱，在制備納米粒時(shí)，藥物容易吸附在聚己內(nèi)酯的表面，通過聚乙二醇修飾聚己內(nèi)酯，使得聚己內(nèi)酯的親水性提高，改善材料的疏水性與降解性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚乙二醇-聚己內(nèi)酯載體材料的用量對(duì)納米粒的穩(wěn)定性影響較大：一定范圍內(nèi)(50、100、150 mg)，隨著聚乙二醇-聚己內(nèi)酯用量的增加，姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的粒徑、多分散系數(shù)變大，包封率增加，但當(dāng)使用量達(dá)到200 mg時(shí)，制備的姜黃素聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒易破損而沉淀。

姜黃素為水難溶性藥物，為了使得姜黃素在體外釋放介質(zhì)中溶解，可在釋放介質(zhì)中加入表面活性劑[13]，達(dá)到漏槽條件。本實(shí)驗(yàn)分別在釋放介質(zhì)中加入十二烷基磺酸鈉、tween-20和乙醇等表面活性劑，考察十二烷基磺酸鈉、tween-20和乙醇對(duì)姜黃素釋放度的影響。結(jié)果表明，在含十二烷基磺酸鈉(濃度5%)或tween-20(濃度5%)的PBS緩沖液(pH 5.8)中，姜黃素的累積釋放度均不符合漏槽要求，而在含乙醇(濃度20%)的PBS緩沖液(pH 5.8)累積釋放度符合漏槽要求，故選擇含20%乙醇的PBS緩沖液(pH 5.8)為釋放介質(zhì)。