李明瑛，牛文一，姚恒波，席秀娥，王 霞

0 引言

肺結(jié)核是臨床常見的肺部慢性傳染性疾病，流行病學調(diào)查顯示，近年來，其發(fā)病率及死亡率均呈升高趨勢。肺結(jié)核多因結(jié)核分枝桿菌感染引起，飛沫傳播為主要傳播途徑，常累及肺臟，多發(fā)生在成人，病程長，易復發(fā)[1]。世界衛(wèi)生組織在阻止結(jié)核策略中提出了該病標準化療方案，復治涂陽肺結(jié)核者每日化療方案為3HRZE/6HRE，即強化期3個月異煙肼(Isoniazid，INH，簡稱H)、利福平(Rifampin，RFP，簡稱R)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA，簡稱Z)、乙胺丁醇(Ethambutol，EMB，簡稱E)四藥聯(lián)用，鞏固期6個月H、R、E三藥聯(lián)用，能取得較為滿意的臨床效果[2]。其中，利福平作為開發(fā)較早的利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，較異煙肼、鏈霉素而言，其殺滅結(jié)核菌活性更強，具有高效、半衰期延長、抗耐藥等特點，療效確切，目前已成為抗結(jié)核的主要藥物[3]。然而，有報道，由于患者藥物代謝率不同，導致不同患者應(yīng)用同等劑量藥物后療效與不良反應(yīng)差異明顯；其中，利福平個體血藥濃度差異若較大，治療效果則不盡相同[4]。因此，本文主要探究不同利福平血藥濃度對肺結(jié)核患者免疫功能的影響，旨在為復治涂陽肺結(jié)核免疫治療提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用隨機平行對照方法納入2014年5月至2017年5月于我院收治的接受3HRZE/6HRE常規(guī)化療方案治療的86例肺結(jié)核患者為研究對象，開展前瞻性研究。抽取患者清晨靜脈血2 ml，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測利福平血藥濃度，結(jié)果為5.55～11.26 mg/L，中位值9 mg/L，按照所有患者利福平血藥濃度中位值高低將其分為2組，其中觀察組54例，利福平血藥濃度9～11.26 mg/L；對照組32例，利福平血藥濃度5.55～8.99 mg/L。本研究獲我院醫(yī)學倫理委員會批準，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

1.2 納入標準 ①符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[5]中相關(guān)診斷標準，伴有發(fā)熱、胸痛、咳嗽等癥狀，涂片或培養(yǎng)、痰液檢查見(或未見)抗酸桿菌，X線檢查提示存在肺部病灶；肺部病理組織檢查提示存在典型結(jié)核小結(jié)；②抗結(jié)核治療前肝功能正常；③近2年內(nèi)未接受免疫抑制劑治療；④年齡≥18歲，復治涂陽肺結(jié)核者，即初治失敗、規(guī)則用藥滿療程后痰菌復陽、慢性排菌或不規(guī)則化療>1個月的肺結(jié)核患者；⑤患者對本研究知情且簽署同意書。

1.3 排除標準 ①合并病毒性肝炎、自身免疫型肝炎、酒精性肝病、低氧血癥、充血性心力衰竭、菌血癥等可引起肝功能異常的疾??；②伴糖尿病、艾滋病、長期應(yīng)用激素等；③合并精神病及癲癇病史者；④過敏體質(zhì)或?qū)Ρ狙芯克幬镞^敏者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 方法

1.4.1 治療方法 行3HRZE/6HRE治療。強化期，維持3個月。異煙肼(沈陽紅旗制藥有限公司，國藥準字H21022350，規(guī)格0.1 g/片)0.3 g/次，qd；利福平(廣東華南藥業(yè)集團有限公司，國藥準字H44020771，規(guī)格0.15 g/片)0.45 g/次，qd；吡嗪酰胺(成都錦華藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H51020877，規(guī)格0.25 g/片)1.5 g/次，qd；乙胺丁醇(杭州民生藥業(yè)有限公司，國藥準字H33021602，規(guī)格0.25 g/片)0.75 g/次，qd。鞏固期，維持6個月。異煙肼0.3 g/次，qd；利福平0.45 g/次，qd；乙胺丁醇0.75 g/次，qd。

1.4.2 利福平血藥濃度檢測方法 所有患者每日按時按量口服抗結(jié)核藥物，于第7天清晨空腹服藥后2 h采集肘靜脈血2 ml，置入乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetracetic acid，EDTA)抗凝管，于低溫高速離心機(德國Eppendorf)內(nèi)以3 000 r/min速度離心10 min，吸出上清液后裝入1.5 ml凍存管內(nèi)，置于液氮罐儲存。采用Agilent 1260型高效液相色譜(美國Agilent)，以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，以甲醇∶水(70∶30)為流動相，流速為1 ml/min，檢測波長為340 nm，測定利福平血藥濃度。利福平標準品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

表1 兩組患者一般資料比較(例,%)

1.4.3 免疫細胞檢測方法 在治療前后采集患者外周靜脈血5 ml，留取乙二胺四乙酸抗凝血標本，血漿離心后置入-80 ℃冰箱冷凍保存。采用FACSCalibur型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)，測定機體免疫細胞CD4+T細胞、CD8+T細胞百分比及調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory cells，Treg)、骨髓來源抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)水平。異硫氰酸酯熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的抗CD3抗體、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標記的CD4抗體及MDSC標記抗體PE-CD11b、FITC-CD33、APC-HLA-DR，均由Beckman Coulter公司生產(chǎn)。Treg細胞標測試劑盒購于美國Thermo scientific公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 血清炎性因子檢測方法 使用UniCel DxI 800全自動化學發(fā)光免疫分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，以雙抗體放免分析法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，以酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)水平，試劑盒均購自上海碧云天生物有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 細菌學檢測方法 于治療前留取患者痰涂片3次，每次結(jié)果呈陽性。治療過程中每月復留取痰涂片，直至治療結(jié)束。痰菌轉(zhuǎn)陰率判斷：參考《中國結(jié)核病分類法》[6]，連續(xù)2個月痰菌培養(yǎng)為轉(zhuǎn)陰未復陽者。

1.5 觀察指標 觀察兩組血清炎性因子TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平，對比免疫功能指標CD4+、CD8+、Treg、MDSCs百分比及CD4+/CD8+比值，并分析強化期結(jié)束時、治療結(jié)束時及結(jié)束后1個月痰菌轉(zhuǎn)陰率。比較兩組不良反應(yīng)發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清炎性因子水平比較 觀察組治療后TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平均顯著低于治療前及對照組治療后(P<0.05)，見表2。

2.2 兩組免疫功能指標比較 觀察組治療后CD4+、CD4+/CD8+水平顯著高于治療前及對照組治療后(P<0.05)，Treg細胞、MDSCs水平顯著低于治療前及對照組治療后(P<0.05)，CD8+水平與治療前及對照組治療后比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 兩組痰菌轉(zhuǎn)陰率比較 觀察組強化期結(jié)束時、治療結(jié)束時及結(jié)束后1個月痰菌轉(zhuǎn)陰率均顯著高于對照組(P<0.05)，見表4。

表2 兩組血清炎性因子水平比較

注：與治療前比較，*P<0.05;與對照組比較，#P<0.05

表3 兩組免疫功能指標比較

注：與治療前比較，*P<0.05;與對照組比較，#P<0.05

表4 兩組痰菌轉(zhuǎn)陰率比較(例，%)

2.4 兩組不良反應(yīng)觀察 兩組未見嚴重不良反應(yīng)發(fā)生，肝腎功能檢查無異常，觀察組1例輕度惡心、嘔吐，可耐受，未經(jīng)干預(yù)后自行緩解。兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

有報道，復治涂陽肺結(jié)核患者免疫功能紊亂是引起其復發(fā)及細菌擴散的關(guān)鍵原因[7]。目前，復治涂陽肺結(jié)核患者多采用3HRZE/6HRE方案治療，其中利福平作為一線抗結(jié)核病首選藥物之一，靜脈注射0.5 h后血藥濃度可達最高峰，藥物廣泛分布于全身，直接參與血液循環(huán)，具有廣譜殺菌功效，能有效抑制宿主細胞中細菌大量繁殖[8]。但由于個體間血藥濃度差異較大，尤其合并肝臟損傷的結(jié)核病患者更為明顯，既往經(jīng)驗劑量已難反映其臨床療效[9]。對此，筆者主要立足于利福平血藥濃度角度，探究其與肺結(jié)核患者免疫系統(tǒng)缺陷的相關(guān)性，旨在指導臨床治療。

本研究結(jié)果顯示，觀察組治療后TNF-α、CRP、IL-6、IL-10水平均明顯低于治療前及對照組治療后，證實利福平血藥濃度升高可有效降低復治涂陽肺結(jié)核患者機體炎癥因子水平。研究表明，活動性肺結(jié)核患者在抗結(jié)核治療中，其血清促炎因子(如IL-6、IFN-γ等)呈現(xiàn)動態(tài)變化，與患者病情發(fā)展、預(yù)后轉(zhuǎn)歸存在直接關(guān)系[10]。具體而言，TNF-α為多功能炎性細胞因子，能有效激活I(lǐng)L-6等炎性因子釋放，促進內(nèi)皮素生成；CRP屬于非特異性炎性標志物，當心肌細胞缺血缺氧性損傷出現(xiàn)時其濃度會持續(xù)升高，在誘發(fā)血管炎癥、促進血栓形成中具有重要作用；IL-6為促進炎癥反應(yīng)類因子，多由成纖維細胞、巨噬細胞、T細胞等產(chǎn)生，能誘導CRP生成，引起血小板聚集，促使炎癥細胞聚集、黏附及新生內(nèi)膜生成，加快機體對炎癥反應(yīng)速度；IL-10為抑制炎癥反應(yīng)類細胞因子，能誘導CD4+T細胞及CD8+T細胞活性下降，抑制細胞介導的相關(guān)免疫應(yīng)答[11]。有報道，伴隨著肺結(jié)核病灶范圍的逐漸增大，空洞出現(xiàn)，患者機體免疫功能明顯下降，易遭受結(jié)核分枝桿菌侵襲，引起肺組織破壞，出現(xiàn)肺部炎癥反應(yīng)，導致炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-10等大量分泌[12]。利福平屬于利福霉素類抗結(jié)核藥，脂溶性較好，能達到較高的組織血漿濃度比值，血藥濃度升高，可更好地調(diào)節(jié)促炎及抗炎細胞因子水平，抑制炎癥滲出，減少炎癥介質(zhì)釋放，改善炎癥遞質(zhì)及患者血液動力學，減輕組織病理損傷，起到免疫抗感染作用[13]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組治療后CD4+、CD4+/CD8+水平明顯高于治療前及對照組治療后，且Treg細胞、MDSCs水平明顯低于治療前及對照組治療后，證實利福平血藥濃度升高可有效改善復治涂陽肺結(jié)核患者免疫功能。有報道，T淋巴細胞介導的免疫應(yīng)答反應(yīng)與肺結(jié)核病情進展、恢復存在一定關(guān)聯(lián)，很大程度上免疫損傷會促使受抑結(jié)核分枝桿菌再次活躍，并重新侵入機體進行繁殖，致使病灶惡化進而發(fā)病[14]。而謝永國等[15]通過監(jiān)測老年患者體內(nèi)利福平濃度水平并對其藥代動力學特征進行研究，發(fā)現(xiàn)利福平血藥濃度對肺結(jié)核患者機體免疫水平存在一定的影響。T細胞免疫有中心調(diào)控作用，能反映機體細胞免疫狀態(tài)，其中CD4+T細胞屬于輔助性淋巴細胞，能促進多種細胞因子大量分泌，增強細胞免疫反應(yīng)，與NK細胞具有協(xié)同作用；CD8+T細胞包括抑制性T細胞與殺傷性T細胞，二者會引起免疫應(yīng)答抑制效應(yīng)，促使可溶性抑制因子大量分泌，經(jīng)分泌穿孔素或直接殺傷作用將感染細胞殺死；CD4+/CD8+比值為評估患者細胞免疫功能的關(guān)鍵參考指標，若CD4+/CD8+比值下降，則提示細胞免疫失衡，表明患者免疫功能低下[16]。而Treg細胞能抑制Th1細胞免疫反應(yīng)，減少IFN-γ分泌，抑制機體免疫應(yīng)答。胡群英等[17]通過檢測結(jié)核病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞水平，結(jié)果顯示，與健康對照者比較，肺結(jié)核患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細胞數(shù)量明顯增加，并證實其能抑制PBMC及CD4+CD25+T細胞對BCG的增殖反應(yīng)及細胞因子的分泌，促使Th1細胞免疫反應(yīng)受抑，表明其在結(jié)核免疫中具有重要作用。而MDSC屬于一群免疫抑制性細胞，在外傷、炎癥等病理狀態(tài)下，其數(shù)量明顯升高，能抑制免疫細胞應(yīng)答，誘導Treg形成，間接抑制機體免疫應(yīng)答。有報道，在不明顯改變用藥安全性前提下，需增加利福平用藥劑量，促使其血藥濃度高于最低抑菌濃度，從而提高其殺菌及抑菌活力，增強療效[18]。筆者認為，高濃度利福平能有效殺滅結(jié)核分枝桿菌，調(diào)節(jié)T淋巴細胞發(fā)育、分化及成熟，并修復受損T淋巴細胞，活化CD4+T、CD8+T細胞，抑制TNF-α、CRP、IL-6、IL-10等炎癥因子，促進機體免疫功能恢復。

本研究結(jié)果顯示，觀察組強化期結(jié)束時、治療結(jié)束時及結(jié)束后1個月痰菌轉(zhuǎn)陰率明顯高于對照組，證實利福平血藥濃度升高可有效提高復治涂陽肺結(jié)核患者痰菌陰轉(zhuǎn)率。有報道，感染部位組織中的藥物濃度與藥物療效密切相關(guān)，為確保組織中能達到有效治療濃度，藥物血藥濃度應(yīng)達到致病菌最低抑菌濃度的2倍及以上[19]。藥物必須在病灶部位達到足夠濃度，才能殺滅或抑制組織深部潛伏的致病菌，而藥物進入組織中的濃度與局部血流量、藥物理化特性、血漿蛋白結(jié)合率等因素相關(guān)[20]。利福平血藥濃度升高，具有雙重抗菌機制，能殺滅代謝旺盛期及靜止期結(jié)核菌，結(jié)合依賴DNA的RNA多聚酶β亞單位，可抑制細菌RNA合成，預(yù)防該酶與DNA連接，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過程，誘導DNA及蛋白合成停止，增強臨床療效[21]。本研究顯示，兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義。利福平不良反應(yīng)以消化道反應(yīng)為主，一般可耐受，本研究未見嚴重不良反應(yīng)出現(xiàn)，提示利福平安全性較高，而不同血藥濃度未見顯著差異，可能與樣本量較小有關(guān)。需要注意的是，本研究仍存在一些不足之處，如樣本量偏小，干預(yù)時間較短，未涉及安全性研究，故今后需開展高質(zhì)量、多中心、大樣本研究，旨在為臨床治療提供更為可靠的依據(jù)。

綜上，不同利福平血藥濃度對肺結(jié)核患者免疫功能存在一定影響，臨床上應(yīng)給予足夠重視。