孫玉秀，秦寶麗

0 引言

作為好發(fā)于青少年的常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，骨肉瘤常常被認(rèn)為是兒童及青少年中癌癥相關(guān)性死亡的常見病因[1]。骨肉瘤為起源于間充質(zhì)細(xì)胞的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其惡性程度極高，生長非常迅速，轉(zhuǎn)移早，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后常常不佳[2-3]。盡管近年來包括外科切除和化學(xué)治療在內(nèi)的綜合治療取得了一定的進(jìn)展，仍有30%～40%的患者存在復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而且這些病例的平均生存期不足1年[4]。因此，尋找與骨肉瘤增殖相關(guān)的分子并明確其作用機(jī)制，對臨床醫(yī)生和相關(guān)研究者來說都顯得尤為重要。

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的長度約22～25 nt的內(nèi)源性短鏈RNA[5]。MiRNAs通過轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各自的靶基因表達(dá)，從而在腫瘤中發(fā)揮了癌基因或抑癌基因的作用[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在多種腫瘤中表達(dá)增高且參與到腫瘤的增殖凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為過程中[7-10]。本研究擬從細(xì)胞學(xué)水平探討miR-140-5p在骨肉瘤中的表達(dá)，并研究其對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖能力的影響，進(jìn)一步明確其對人骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖的影響能否通過靶向抑制組蛋白脫乙?；?(Histone deacetylase 4，HDAC4)基因來實(shí)現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63以及人成骨細(xì)胞系hFOB1.19均購買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；RNA提取試劑盒，Reverse Transcription 試劑盒，PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；CCK8試劑盒購自sigma公司；HDAC4兔源單克隆抗體購自Abcam公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-140-5p 模擬物(miR-140-5p mimics)及空白對照模擬物(Negative control mimic,NC mimic)由廣州銳博生物科技有限公司化學(xué)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液中并置于35 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)；人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中并置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。以上兩種培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)。

1.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個細(xì)胞/孔并接種于6孔板中，添加完全培養(yǎng)基孵育24 h后，根據(jù)說明書采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染，將50 nmol/L miR-140-5p mimics和相應(yīng)的NC mimic分別轉(zhuǎn)染到各自的細(xì)胞組中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 載體構(gòu)建及熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 含有野生型及突變型miR-140-5p作用位點(diǎn)的HDAC4雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒(wt-HDAC4-luc及mut-HDAC4-luc)由上海吉瑪生物公司合成。將MG-63細(xì)胞接種于24孔板中，按照LipofectamineTM3000說明書轉(zhuǎn)染干預(yù)因素，同時共轉(zhuǎn)染wt-HDAC4-luc或mut-HDAC4-luc與miR-140-5p mimics或NC mimic。轉(zhuǎn)染24 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測法檢測，具體操作見說明書。

1.2.4 CCK8法檢測MG-63細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞，胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2×103并接種于96孔板中，每孔加入DMEM培養(yǎng)基200 μl并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至50%融合時，更換無血清培養(yǎng)基同步化。24 h后，加入血清，不同時間(24 h、48 h、72 h)加入10 μl CCK8液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，室溫孵育10 min，上機(jī)測定A490 nm,以該值代表細(xì)胞活力。

1.2.5 Western blot檢測HDAC4蛋白表達(dá) 分組轉(zhuǎn)染48 h后提取各組細(xì)胞的總蛋白并分組標(biāo)記，BCA法測定各組蛋白濃度。取200 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。封閉1 h后，分別加入HDAC4一抗(稀釋比例為1∶500)，同時加入GAPDH一抗(稀釋比例1∶500)作為對照，孵育過夜；第2天，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋比率為1∶1 000)室溫下孵育1 h。參照ECL試劑盒說明書行電化學(xué)發(fā)光檢測，采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，并分組計(jì)算HDAC4蛋白相對表達(dá)量。

1.2.6 實(shí)時熒光定量 PCR檢測miR-140-5p及HDAC4 mRNA的表達(dá) 采用Trizol分組提取各組細(xì)胞的總RNA。取50 μg總RNA并使用Invitrogen的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按試劑盒說明書合成cDNA。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR過程按Invitrogen的SYBR Green 實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量儀上進(jìn)行，分別設(shè)定GAPDH及U6作為HDAC4及miR-140-5p的內(nèi)參照，引物序列見表1。以 HDAC4 mRNA拷貝數(shù)與內(nèi)參照GAPDH mRNA 拷貝數(shù)的比值為 HDAC4的相對表達(dá)量；miR-140-5p拷貝數(shù)與內(nèi)參照U6 拷貝數(shù)的比值為 miR-140-5p的相對表達(dá)量。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19中miR-140-5p及HDAC4的差異表達(dá) 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中miR-140-5p呈低表達(dá)而HDAC4呈高表達(dá)，如圖1所示，Realtime-PCR及Western blot結(jié)果顯示，與正常成骨細(xì)胞系相比，人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中miR-140-5p表達(dá)明顯降低(圖1A)，HDAC4表達(dá)明顯升高(圖1B)。

圖1 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19中miR-140-5p及HDAC4的差異表達(dá)

2.2 上調(diào)miR-140-5p抑制HDAC4的表達(dá) 在MG-63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics，并通過qRT-PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。結(jié)果如圖2A所示，相比轉(zhuǎn)染NC mimic組，轉(zhuǎn)染miR-140-5p組的MG-63細(xì)胞內(nèi)的miR-140-5p表達(dá)明顯升高。我們進(jìn)一步考察了上調(diào)miR-140-5p對HDAC4表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于NC mimic轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics也即上調(diào)miR-140-5p后，HDAC4的表達(dá)明顯降低(見圖2B、圖2C)。

圖2 上調(diào)miR-140-5p抑制HDAC4的表達(dá)

2.3 上調(diào)miR-140-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖 我們通過CCK8法考察了上調(diào)miR-140-5p對骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖的影響。如圖3所示，相比轉(zhuǎn)染NC mimic組，轉(zhuǎn)染miR-140-5p組的MG-63細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，即上調(diào)miR-140-5p，可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63的增殖能力。

圖3 上調(diào)miR-140-5p抑制骨肉瘤細(xì)胞MG-63增殖

2.4 miR-140-5p 可與HDAC4 3′UTR靶向結(jié)合 我們首先通過tagetscan在線理論預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，HDAC4基因的3′UTR與miR-140-5p存在理論上的7個堿基互補(bǔ)區(qū)，見圖4A。進(jìn)一步的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，野生型HDAC報告質(zhì)粒(wt-HDAC4-luc)和 miR-140-5p mimics 共轉(zhuǎn)染后，MG-63細(xì)胞的熒光素酶活性比wt-HDAC4-luc 和NC mimic組共轉(zhuǎn)染組明顯降低 (P<0.05)；但將理論上的HDAC4 3′UTR與 miR-140-5p 的結(jié)合位點(diǎn)做了突變后(共轉(zhuǎn)染wt-HDAC4-luc與miR-140-5p mimics)，熒光素酶活性復(fù)又升高，也就是miR-140-5p能夠靶向作用于HDAC4 3′UTR，見圖2B。

2.5 HDAC4 cDNA逆轉(zhuǎn)miR-140-5p對MG-63增殖的抑制效應(yīng) 我們將HDAC4 cDNA質(zhì)粒(oe-HDAC4)及對應(yīng)的空白載體質(zhì)粒(pcDNA)與miR-140-5p mimics共轉(zhuǎn)染，并再次檢測HDAC4的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于miR-140-5p mimics組及空白載體共轉(zhuǎn)染組(miR-140-5p mimics+pcDNA組)，miR-140-5p mimics+oe-HDAC4組的HDAC4的表達(dá)明顯升高(見圖5A、圖5B)。我們進(jìn)一步檢測了這三組細(xì)胞的增殖能力變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于miR-140-5p mimics組及空白載體共轉(zhuǎn)染組(miR-140-5p mimics + pcDNA組)，miR-140-5p mimics + oe-HDAC4組細(xì)胞的增殖能力明顯得到了提升(見圖5C)。

圖4 熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測 miR-140-5p與 HDAC4 3′UTR結(jié)合

圖5 HDAC4 cDNA逆轉(zhuǎn)miR-140-5p對MG-63增殖的抑制效應(yīng)

3 討論

miRNA是一類在進(jìn)化上高度保守且在真核生物廣泛表達(dá)的小分子單鏈RNA，通常miRNA不具有編碼功能。miRNA的表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性及時間特異性，而miRNA的失常表達(dá)往往與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起到了至關(guān)重要的調(diào)控者角色。一般來講，參與腫瘤進(jìn)展的miRNA有兩大類，一類能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活及侵襲轉(zhuǎn)移，另一大類則起到相反的作用[11]。研究表明，miRNA在多種腫瘤組織中都存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，并在腫瘤的進(jìn)程中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的效應(yīng)[12]。

人miRNA-140-5p(序列號MIMAT0000431)，既往也稱miR-140，位于人染色體16q22.1，廣泛參與多種腫瘤的多種生物學(xué)行為。Fang等[7]發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p能夠通過調(diào)控YES原癌基因1(YES proto-oncogene 1，YES1)的表達(dá)并抑制胃癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Yuan 等研究認(rèn)為，miR-140-5p能夠抑制胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor)的表達(dá)并抑制其介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Wei等[13]報道，miR-140-5p能夠通過打靶肌醇1，4，5-三磷酸激酶(Inositol 1,4,5-trisphosphate kinase 2，IP3k2)的方式，減輕化學(xué)藥物誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞死亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p在人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中表達(dá)降低。通過轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics的方式上調(diào)miR-140-5p的表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞系MG-63的增殖能力與NC mimic組相比明顯降低，表明miR-140-5p在骨肉瘤細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。人組蛋白脫乙?；?(Histone deacetylase 4，HDAC4)基因位于人染色體2q37.3，其mRNA長度為8 980 bp，共含有37個外顯子，因此，HDAC4具有極為復(fù)雜的生物學(xué)功能。Zeng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC4在食管癌中表達(dá)增高并與食管癌的不良預(yù)后及腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。Wu等[15]報道，HDAC4在骨肉瘤中表達(dá)增高，上調(diào)miR-145-3p可抑制HDAC4的表達(dá)，并抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡及自噬的發(fā)生。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，HDAC4與骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[16]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，HDAC4在人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中表達(dá)明顯增高。在MG-63中上調(diào)miR-140-5p后，HDAC4的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低，提示miR-140-5p可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控HDAC4的表達(dá)。同時，我們通過targetsan在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p與HDAC4 3′ UTR區(qū)存在7個堿基互補(bǔ)區(qū)的miRNA作用元件(MicroRNA response elements，MREs)。因此，我們進(jìn)一步通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證理論上的miR-140-5p與HDAC4 3′ UTR的靶向結(jié)合作用是否存在。結(jié)果證實(shí)，miR-140-5p可通過理論上的miRNA作用元件靶向結(jié)合于HDAC4 3′ UTR區(qū)，即HDAC4是miR-140-5p的靶基因之一。最后我們通過構(gòu)建的反義實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證HDAC4在miR-140-5p介導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞增殖中的作用。結(jié)果顯示，當(dāng)我們將HDAC4 cDNA轉(zhuǎn)染到miR-140-5p過表達(dá)的細(xì)胞模型內(nèi)后，miR-140-5p對骨肉瘤細(xì)胞MG-63的抑制作用被明顯翻轉(zhuǎn)，也就是說HDAC4是miR-140-5p介導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)基因。以上研究結(jié)果提示，miR-140-5p可通過靶向結(jié)合于HDAC4 3′ UTR區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平抑制HDAC4的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞系MG-63的增殖。

綜上所述，miR-140-5p可通過靶向結(jié)合于HDAC4的3′ UTR區(qū)，并干擾HDAC4的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果提示，miR-140-5p/HDAC4軸在骨肉瘤細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，miR-140-5p/HDAC4軸有望成為分子治療骨肉瘤的靶基因。