隋 軼，徐 冰，任 莉，董春瑤，張 堯

0 引言

阿爾茨海默病(AD)是目前老年人癡呆的主要原因之一，其主要病理標(biāo)志包括由星形膠質(zhì)細(xì)胞和微膠質(zhì)細(xì)胞包圍的細(xì)胞外淀粉樣蛋白β(Aβ)沉積共同構(gòu)成的老年斑；小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元纖維纏結(jié)的細(xì)胞內(nèi)積累(由過度磷酸化的tau組成)，以及神經(jīng)元和突觸的喪失[1-2]。絕大多數(shù)AD病例發(fā)病晚，通過治療或預(yù)防能明顯延遲發(fā)病年齡[3]。越來越多的證據(jù)表明，由活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和神經(jīng)毒素在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[4]。由于它們?cè)谡{(diào)節(jié)神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞交互影響中的關(guān)鍵作用，趨化因子在AD研究中引起了越來越多的關(guān)注[5]。因此，探討趨化因子在AD病理學(xué)中的作用，有助于對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的理解及開發(fā)新的AD治療方法。

CCL11可能是參與AD病理學(xué)的一種重要趨化因子。在衰老過程中，CCL11在血清中逐漸升高，其年齡依賴性增加與海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)的缺陷相關(guān)[6]。因此，CCL11很可能是影響海馬功能的關(guān)鍵因素，并與AD有密切關(guān)聯(lián)。相關(guān)機(jī)制可能是CCL11與一種由星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)的趨化因子受體CCR3相結(jié)合[7-10]。本研究觀察特異性CCR3拮抗劑GW766994是否通過拮抗趨化因子CCL11的作用影響AD的病理變化。

1 資料和方法

1.1 體視學(xué)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析 應(yīng)用熒光或光學(xué)顯微鏡進(jìn)行體視學(xué)分析，油浸100×物鏡。使用無偏立體細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)的光學(xué)分離器方法計(jì)數(shù)海馬中Aβ斑和p-Tau陽性神經(jīng)元的數(shù)量[11-12]。

1.2 蛋白質(zhì)印跡分析[11]將細(xì)胞或腦組織在含有蛋白酶抑制劑混合物的TBS(20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH=7.4,150 mmol/L NaCl)中勻漿，包括0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟，20 μg/ml 抑肽酶，20 μg/ml亮抑酶肽，20 μg/ml 胃蛋白酶抑制劑和1 ml EDTA(所有從Sigma獲得的抑制劑)。將勻漿物短暫超聲處理并以15 000×g離心30 min。在還原條件下，將樣品(每泳道10 μg 蛋白質(zhì))在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(GE Healthcare)膜上。用含有0.1%Tween 20、3%干乳的TBS封閉膜1 h，然后在室溫下用特異性抗體孵育2 h。洗滌后，將印跡與相應(yīng)的HRP標(biāo)記的第二抗體(1∶1 000稀釋)一起溫育1 h。使用ECL系統(tǒng)(GE Healthcare)檢測(cè)標(biāo)記。使用光密度測(cè)定軟件(Scion Image)分析條帶。后續(xù)抗體用于蛋白質(zhì)印跡：兔多克隆抗APPC末端片段(CTF)(Sigma)，小鼠單克隆抗p-tau(T181)(1∶500;Abcam)，兔多克隆抗p-tau(T205)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，兔多克隆抗p-tau(Ser199)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，兔多克隆抗p-tau(Ser235)(1∶1 000;Santa Cruz)Biotechnology)，小鼠單克隆抗細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗p-ERK1/2(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗p-CDK5(Ser159)(1∶200;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗p-糖原合成酶激酶3β(GSK3β)(Ser9)(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗磷酸化GSK3α/β(Tyr279/216)(1∶1 000;ECM Biosciences)，兔多克隆抗tau(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗GSK3β(1∶4 000;Sigma)，小鼠單克隆抗ERK2(1∶1 000;Santa Cruz Biotechnology)，小鼠單克隆抗β-actin(1∶4 000;Sigma)。GW766994為同濟(jì)大學(xué)范國煌教授饋贈(zèng)。

1.3 樹突棘的數(shù)量測(cè)定 利用Matlab 軟件分析樹突長(zhǎng)度和這些神經(jīng)元中蘑菇刺的數(shù)量。

1.4 原代神經(jīng)元培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染[13]在胚胎第18～19天,從大鼠胎兒制備。在手術(shù)顯微鏡下解剖胚胎大鼠海馬組織，并用0.15%胰蛋白酶在37 ℃消化10～15 min。通過添加10%補(bǔ)充的DMEM結(jié)束消化胎牛血清。用70 μm細(xì)胞過濾器過濾海馬神經(jīng)元懸浮液，然后在有或沒有聚-D-賴氨酸氫溴酸鹽包被的蓋玻片的培養(yǎng)板中鋪板。將細(xì)胞維持在補(bǔ)充有10%FBS和1%Pen/Strep的DMEM中。接種后12 h，用含有2% B27補(bǔ)充物、1% Glutamax和1%Pen/Strep的Neurobasal培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。對(duì)于形態(tài)學(xué)研究，使用Lipofectamine 2000在體外培養(yǎng)7 d瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EGFP載體的神經(jīng)元培養(yǎng)物。在蓋玻片上生長(zhǎng)的神經(jīng)元(14 DIV)用PBS洗滌，并在室溫下在4%甲醛(pH 7.4)中固定15 min。然后用SlowFade Light試劑(Molecular Probes，Eugene，OR)安裝在載玻片上。

1.5 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中Aβ水平的ELISA分析 使用高度敏感夾心ELISA試劑盒(Immuno-Biological Laboratories，Gunma，Japan)測(cè)量原代細(xì)胞培養(yǎng)基中Aβ的濃度。簡(jiǎn)言之，單克隆兔抗人IgG抗Aβ35-40或抗Aβ38-42分別用于標(biāo)記Aβ1-40和Aβ1-42。辣根過氧化物酶綴合的抗人Aβ11-28Fab用于以上2種測(cè)定中的檢測(cè)[14]。該檢測(cè)抗體識(shí)別Aβ1-40的整合和N-末端切割的變體和Aβ1-42。Aβ1-40和Aβ1-42的測(cè)量范圍分別為4～231 pmol/L和3～178 pmol/L。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)和共聚焦顯微鏡[15]將細(xì)胞用含有4%多聚甲醛的PBS(pH 7.4)固定15 min，然后用PBS中的0.5% Triton X-100膜透化5 min。在37 ℃下用3%牛血清白蛋白封閉1 h后，將細(xì)胞與以下一抗孵育：兔多克隆抗MAP2抗體(1∶200，Sigma)和小鼠單克隆抗CCR3抗體(1∶200，Santa Cruz)，4 ℃過夜。然后將細(xì)胞與綴合至花青3(Cy3，1∶500;Jackson ImmunoResearch)或Alexa 488(1∶500;Molecular Probes)的二抗一起溫育。使用具有25×或63×水浸物鏡 LSM 510 Zeiss顯微鏡獲得熒光圖像。所有圖像均以512×512像素分辨率拍攝。

2 結(jié)果

2.1 CCR3在14 DIV海馬神經(jīng)元中的表達(dá) 用抗CCR3和抗MAP2抗體共同免疫染色海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物(14 DIV)，發(fā)現(xiàn)CCR3和MAP2表達(dá)神經(jīng)元之間的共定位(圖1A)，而用同種型對(duì)照IgG的免疫染色未顯示CCR3信號(hào)(圖1B)，表明CCR3在神經(jīng)元中的特異性表達(dá)。通過計(jì)數(shù)每組200個(gè)神經(jīng)元，觀察到100%神經(jīng)元表達(dá)CCR3。

圖1 CCR3在14 DIV海馬神經(jīng)元中的表達(dá)

注：免疫熒光顯示海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中MAP2的CCR3的共定位(14 DIV)。Scale bar=50 μm

2.2 CCL11處理導(dǎo)致CDK5的激活 CCL11在治療野生鼠(非CCR3- / -小鼠)的海馬神經(jīng)元時(shí)(圖2)，可導(dǎo)致CDK5的激活，CDK5是一種蛋白激酶，在AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用[16]。

圖2 CCL11處理導(dǎo)致CDK5的激活

注：來自野生型或CCR3- / -小鼠的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物(14 DIV)的細(xì)胞裂解物中，在CCL11(10 nmol/L)不存在或存在條件下共培養(yǎng)30 min，磷酸化CDK5(Ser159)和CDK5的蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果

此外，CCL11誘導(dǎo)的CDK5活化被CCR3特異性拮抗劑GW766994(10 μmol/L)，以劑量依賴的方式所逆轉(zhuǎn)(圖3)。

圖3CCL11誘導(dǎo)的CDK5活化被CCR3特異性拮抗劑劑量依賴性逆轉(zhuǎn)

注：A.在存在或不存在不同濃度GW766994的情況下，給予或不給予CCL11(10 nmol/L)處理的30 min海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物(14 DIV)細(xì)胞裂解物中磷酸化CDK5(Ser159)和CDK5的蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果。B.磷酸化CDK5的定量分析。數(shù)據(jù)表示為未處理樣本值的倍數(shù)。通過單向ANOVA分析，與未處理組相比,*P≤0.05，**P≤0.01

2.3 CCL11處理導(dǎo)致CDK5和GSK 3β磷酸化的時(shí)間依賴性增加，從而介導(dǎo)Tau蛋白磷酸化增加 處理海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物(14 DIV)與CCL11(10 nmol/L)不同的時(shí)間間隔后，導(dǎo)致CDK5和GSK3β磷酸化時(shí)間依賴性增加，后者在AD發(fā)病機(jī)制中也起著重要的作用[16]。CDK5和GSK3β磷酸化可以通過GW766994(10 μmol/L)(一個(gè)CCR3特異性拮抗劑)預(yù)處理而逆轉(zhuǎn)，表明這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑是通過CCR3介導(dǎo)的(圖4)。

主要通過CDK5和GSK3β介導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化是AD的主要標(biāo)志,用CCL11(10 nmol/L)處理海馬神經(jīng)元(14 DIV)15 min，導(dǎo)致在幾個(gè)測(cè)試位點(diǎn)(包括T181、T205、S235、S199)的tau磷酸化增加，并且這種變化可被GW766994(10 μmol/L)所逆轉(zhuǎn)(圖5、圖6)。

2.4 CCL11處理導(dǎo)致神經(jīng)元中Aβ產(chǎn)生的時(shí)間依賴性增加 從體外第14天開始，用對(duì)照或不同濃度的CCL11處理原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞48 h，CCL11處理的細(xì)胞中觀察到顯著的時(shí)間依賴性Aβ1-42分泌增加，此變化同樣可被GW766994(10 μmol/L)所逆轉(zhuǎn)。針對(duì)CCL11的處理，Aβ 1-40水平也出現(xiàn)了增加，但這種影響并沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6B)。為了補(bǔ)償培養(yǎng)基的任何不均勻蒸發(fā)，對(duì)培養(yǎng)基樣品進(jìn)行Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定，數(shù)據(jù)以pmol Aβ/100μg蛋白質(zhì)表示(圖6)。

圖4 CCL11處理導(dǎo)致CDK5和GSK3β磷酸化的時(shí)間依賴性

注：A.在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物(體外14 d)的細(xì)胞裂解物中給予CCL11(10 nmol/L)處理，同時(shí)加用或不加用GW766994(10 μmol/L)，不同時(shí)間間隔條件下的磷酸化CDK5(Ser159)、CDK5、磷酸化GSK3α/β(Tyr216)和GSK3β結(jié)果。B.磷酸化的CDK5、GSK3β的定量分析結(jié)果，結(jié)果分別表示為未經(jīng)處理的細(xì)胞值的倍數(shù)。數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。通過單向ANOVA分析差異。與同一治療組的零時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05，**P<0.01；與用載體處理的細(xì)胞相比，#P<0.05，##P<0.01

2.5 CCL11處理導(dǎo)致神經(jīng)元形態(tài)改變 表達(dá)EGFP的海馬神經(jīng)元(14 DIV)在有/無GW766994(10 μmol/L)的條件下用/不用CCL11(10 nmol/L)處理，對(duì)樹突狀復(fù)雜性和樹突棘密度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，CCL11處理導(dǎo)致樹突狀交叉(圖7)數(shù)量及樹突棘(圖7)密度顯著減少，此變化可以被GW766994(圖1)的預(yù)處理所逆轉(zhuǎn)。

3 討論

衰老期間趨化因子在血清中水平升高，目前，其在神經(jīng)變性疾病中的作用正在引起越來越多的關(guān)注。在本研究中，我們證明了誘導(dǎo)CCL11介導(dǎo)了海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中CDK5和GSK3β的活化，與升高的tau磷酸化相關(guān)聯(lián)，增強(qiáng)Aβ的產(chǎn)生，并加速樹突棘的缺失。

圖5用CCL11(10nmol/L)處理海馬神經(jīng)元測(cè)試位點(diǎn)的tau磷酸化及逆轉(zhuǎn)

注：A.海馬神經(jīng)元裂解物經(jīng)過CCL11(10 nmol/L)處理10 min，加用和不加用GW766994(10 μmol/L)的培養(yǎng)物中，磷酸化tau在T181、T205、Ser235、Ser396位點(diǎn)的結(jié)果。B.不同磷酸化位點(diǎn)tau磷酸化的定量分析。量化數(shù)據(jù)表示為未處理樣本值(時(shí)間零)的倍數(shù)。通過單向ANOVA分析差異。與同一治療組的零時(shí)間點(diǎn)比較,*P<0.05，**P<0.01；與用載體處理的細(xì)胞相比,#P<0.05，##P<0.01

圖6用CCL11(10nmol/L)處理海馬神經(jīng)元測(cè)試位點(diǎn)的tau磷酸化及逆轉(zhuǎn)

注：A.在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中CCL11對(duì)可溶性Aβ1-42的影響。Aβ水平通過ELISA方法，在經(jīng)過載體或CCL11處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入或者不加入GW766994的樣本中測(cè)定。數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，通過單向ANOVA分析差異。與未經(jīng)任何處理的細(xì)胞相比，**P<0.01。與經(jīng)過載體溶液和CCL11處理的細(xì)胞相比，##P<0.01。B.在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中CCL11對(duì)可溶性Aβ1-40的影響。方法同上。盡管存在趨勢(shì)，但CCL11處理對(duì)Aβ1-40沒有觀察到顯著影響(P=0.077)

圖7 CCL11處理導(dǎo)致神經(jīng)元形態(tài)改變

在AD患者的大腦中，tau異常過度磷酸化，并且在這種改變的狀態(tài)下，聚集成成對(duì)的螺旋狀細(xì)絲，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)。據(jù)推測(cè)，不同部位的tau蛋白過度磷酸化對(duì)其生物學(xué)功能及其致病作用有不同的影響。在Ser262、Thr231和Ser23位點(diǎn)的 tau過度磷酸化抑制其與微管的結(jié)合[17]，在Ser199/Ser202/Thr205、Thr212、Thr231/Ser235、Ser262/Ser356和Ser422位點(diǎn)的超磷酸化，使tau轉(zhuǎn)換成為一種抑制正常微管相關(guān)蛋白的抑制分子[18]。此外，新皮質(zhì)中神經(jīng)纖維纏結(jié)的密度與癡呆相關(guān)[19]。因此，開發(fā)合理的基于tau的治療藥物需要識(shí)別tau異常過度磷酸化的觸發(fā)因素并理解其內(nèi)在機(jī)制。趨化因子可能是涉及tau蛋白病理的重要因素。例如，CXCL1 通過CXCR2(CXCL1 受體)介導(dǎo)的ERK1/2激活觸發(fā)原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中的tau 蛋白過度磷酸化。最近的一項(xiàng)研究進(jìn)一步表明，用CXCL1處理長(zhǎng)期神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物導(dǎo)致tau以caspase-3依賴性方式切割。在本研究中，發(fā)現(xiàn)CCL11/CCR3在tau蛋白過度磷酸化中發(fā)揮作用?；谟^察到納摩爾濃度的CCL11直接誘導(dǎo)原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中的tau磷酸化，我們認(rèn)為CCL11的年齡依賴性增加是AD的潛在危險(xiǎn)因素。

除了tau蛋白病理外，AD的另一個(gè)重要病理標(biāo)志是通過β-和γ-分泌酶裂解APP所產(chǎn)生的Aβ肽，聚集并在腦中形成的Aβ沉積物。γ-分泌酶將APP C-末端片段切割成2種主要形式的Aβ多肽Aβ40和Aβ42。Aβ42的相對(duì)量對(duì)于AD進(jìn)展特別關(guān)鍵，其比Aβ40肽更容易聚集[20-22]。然而，在散發(fā)AD人群中，APP處理和Aβ產(chǎn)生的觸發(fā)因素仍然很不明確。本研究結(jié)果表明，CCL11在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中以CCR3依賴的方式誘導(dǎo)了顯著的Aβ42增加和中等程度的Aβ40增加。

本研究結(jié)果表明，CCL11/CCR3在 Aβ產(chǎn)生，tau蛋白過度磷酸化和在突觸丟失中起作用，同時(shí)CCL11誘導(dǎo)的蛋白激酶尤其CDK5和GSK3β的活化，也促進(jìn)了上述有害作用的發(fā)生。GW766994作為一種特異性CCR3拮抗劑，顯著逆轉(zhuǎn)了上述過程，為AD治療提供了可能的靶點(diǎn)。我們推測(cè)CCL11的這種增加是Aβ在大腦中產(chǎn)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素，并且早期干擾CCL11/CCR3通路可能延遲AD的發(fā)生。

在本研究中，我們證明CCL11培養(yǎng)導(dǎo)致了CDK5和GSK3β的顯著活化。結(jié)果顯示，CCL11增強(qiáng)了tau磷酸化和Aβ的產(chǎn)生，并與海馬神經(jīng)元培養(yǎng)物中的樹突棘損失有關(guān)。CCR3的特異性拮抗劑GW766994逆轉(zhuǎn)了上述全部過程。因此，拮抗CCR3介導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化，Aβ產(chǎn)生和突觸損失可能會(huì)給AD帶來治療效果。