張樹(shù)偉，張義茹，馬燕斌，李換麗，Rupert Fray，韓淵懷*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

光合作用與光呼吸是植物體內(nèi)重要的碳同化和碳代謝途徑，二者密切聯(lián)系又互相影響。光合作用碳同化階段的第一個(gè)關(guān)鍵酶，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)具有雙重催化特性，既能催化1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)與CO2進(jìn)行羧化反應(yīng)起始光合反應(yīng)碳反應(yīng)過(guò)程，又能催化RuBP與O2進(jìn)行加氧反應(yīng)起始光呼吸反應(yīng)[1～3]。該酶的催化活性依賴于CO2與O2濃度的比值，比值高則促進(jìn)羧化反應(yīng)，比值低則促進(jìn)加氧反應(yīng)[4, 5]。研究發(fā)現(xiàn)植物進(jìn)行光呼吸伴隨著能量的消耗，降低了光合效率，尤其是C3植物，因光呼吸作用較強(qiáng)，可使凈光合速率降低25%～30%[6～8]。因此，減少C3植物的光呼吸消耗，可以間接提高光合效率，從而有助于提高作物產(chǎn)量[9]。

乙醇酸脫氫酶(GDH)是一個(gè)多聚體，由GlcD、GlcE、GlcF 3個(gè)亞基構(gòu)成。細(xì)菌等一些非光合微生物體內(nèi)存在一個(gè)乙醇酸代謝途徑，在GDH參與下將乙醇酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰┧幔胰┧嵩谝胰┧崛┻B接酶(GCL)和羥基丙二酸半醛還原酶(TSR)參與下轉(zhuǎn)變?yōu)楦视退?，使之在不利環(huán)境中正常生長(zhǎng)[10, 11]。Kebeish等[12]利用該細(xì)菌代謝途徑，分別構(gòu)建了編碼GlcD、GlcE、GlcF、GCL和TSR的載體導(dǎo)入擬南芥，在擬南芥中建立一條光呼吸代謝支路。該途徑完全利用原先光呼吸代謝途徑的中間產(chǎn)物，并將原先在線粒體中釋放的CO2變成在葉綠體中釋放，從而使細(xì)胞中CO2/O2比值增加，促進(jìn)Rubisco的羧化反應(yīng)提高了光合作用；獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥生長(zhǎng)更快，株型更大，總生物量比野生型明顯增加。N?lke等[13]構(gòu)建了含有GDH的載體，用35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，轉(zhuǎn)入馬鈴薯中建立光呼吸支路，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯不僅株型比對(duì)照明顯增大，植株總生物量和可溶性糖積累也比對(duì)照顯著增加。Dalal等[14]將GDH構(gòu)建于一個(gè)載體(DEF2)，將GCL和TSR構(gòu)建于一個(gè)載體(GT1)，分別導(dǎo)入亞麻薺中建立光呼吸支路，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系均實(shí)現(xiàn)了減弱光呼吸和增強(qiáng)光合效率；其中獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系(DEF2)的種子產(chǎn)量比野生型增加50%～57%，全支路轉(zhuǎn)基因株系(DEF2+GT1)的種子產(chǎn)量比野生型增加57%～73%；同時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的植被生物量增加，開(kāi)花結(jié)籽到種子成熟的發(fā)育期更快。

本試驗(yàn)擬利用上述構(gòu)建光呼吸支路的思路，克隆大腸桿菌乙醇酸脫氫酶基因GDH，連接含35S強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體上。以陸地棉常規(guī)品種為試驗(yàn)材料R15，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將融合載體導(dǎo)入棉花中[15]。利用分子生物學(xué)方法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，并通過(guò)表型鑒定及生理檢測(cè)，探索棉花中建立光呼吸支路來(lái)提高光合效率進(jìn)而提高產(chǎn)量的可行性，為培育新型高產(chǎn)棉花提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為陸地棉(Gossypiumhirsutum)常規(guī)品種R15，農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所生物技術(shù)室提供。乙醇酸脫氫酶基因GDH由英國(guó)諾丁漢大學(xué)植物科學(xué)院提供，載體pBSK(+)抗性Amp，構(gòu)建的融合基因由35S啟動(dòng)表達(dá)。

EasyPure Plant Genomic DNA Ki，EasyPure HiPure Plasmid MaxiPrep Kit購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司，常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 棉花遺傳轉(zhuǎn)化及再生植株獲得

陸地棉R15經(jīng)濃硫酸脫絨后，于75%乙醇中消毒30 s，雙氧水中消毒3～4 h，滅菌水清洗5～6次后，在超凈臺(tái)上播種于萌發(fā)培養(yǎng)基。在22 ℃暗處培養(yǎng)1周后，將長(zhǎng)出的下胚軸切成0.5～1 cm大小，用于農(nóng)桿菌浸染。

含外源乙醇酸脫氫酶基因的農(nóng)桿菌菌株接種于含Rif和Amp的LB液體培養(yǎng)基中[16]，28 ℃于恒溫?fù)u床200 r·min-1培養(yǎng)過(guò)夜。5000 r·min-1離心5 min收集農(nóng)桿菌體，倒掉上清液，用30 g·L-1葡萄糖溶液懸浮，重復(fù)離心收集菌體一次，再用適當(dāng)體積該溶液懸浮，調(diào)節(jié)OD600值為0.6～0.8，浸染上述已切成小段的下胚軸材料7～8 min，于22 ℃暗處共培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)入含Amp的篩選培養(yǎng)基，于光/暗周期16 h/8 h，恒溫22 ℃人工氣候室培養(yǎng)。每隔20 d換一次新鮮培養(yǎng)基，長(zhǎng)出胚性愈傷組織后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔20 d換一次新鮮培養(yǎng)基。長(zhǎng)出再生幼苗嫁接于溫室，取幼嫩葉片提取DNA進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性株系，于盛花期人工自交并收獲自交種子。

1.3 棉花基因組DNA提取及PCR檢測(cè)

獲得棉花轉(zhuǎn)基因材料種植于山西省農(nóng)科院棉花研究所轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)田，田間常規(guī)管理，出苗4周后取主莖嫩葉置于冷凍管中液氮速凍，并于-80 ℃保存。

利用優(yōu)化過(guò)的CTAB法[17]提取基因組DNA，用對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體反應(yīng)體系(表1)如下：

取5 μL PCR產(chǎn)物于0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并拍照，剩余PCR產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

1.4 光合特性測(cè)定

在晴朗無(wú)風(fēng)的早晨10:00～11:30，選擇棉花打頂前主莖倒4葉，采用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR，Lincoln，USA)測(cè)定葉片的氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)等，采用開(kāi)放式氣路測(cè)定，氣溫為33～36 ℃。每株系重復(fù)3次測(cè)定取平均值。

1.5 表型觀察及干物質(zhì)分析

通過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因棉花不同株系按株行播種于轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)田，對(duì)照(CK)材料選用受體棉花材料R15，田間常規(guī)管理。植株打頂前測(cè)量地上部分株高，果枝數(shù)及子葉節(jié)以上總?cè)~片數(shù)。取轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照材料倒4葉，分別編號(hào)拍照。按編號(hào)測(cè)定各葉片鮮重，裝入牛皮紙信封于烘箱中105 ℃殺青30 min，80 ℃繼續(xù)烘干至恒重，測(cè)定葉片干重，每株系重復(fù)3次測(cè)定取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)基因及再生苗獲得

用含外源基因的農(nóng)桿菌浸染陸地棉下胚軸外植體，在黑暗共培48 h后，轉(zhuǎn)入含100 mg·L-1Amp的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。在該篩選條件下，成功轉(zhuǎn)化的外植體細(xì)胞會(huì)逐漸形成愈傷細(xì)胞，沒(méi)有轉(zhuǎn)化成功的外植體會(huì)褐化死亡(圖1A)；經(jīng)過(guò)一段時(shí)間誘導(dǎo)培養(yǎng)，愈傷細(xì)胞會(huì)快速增殖形成淡黃色愈傷組織(圖1B)；愈傷組織經(jīng)過(guò)3～4次繼代培養(yǎng)出現(xiàn)胚性愈傷，胚性愈傷組織在分化培養(yǎng)基中持續(xù)繼代3～4次分化出幼芽(圖1C)；幼芽繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間出現(xiàn)根和葉片形成幼苗(圖1D)；幼苗在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間后嫁接到砧木上在溫室繼續(xù)培養(yǎng)成活。

圖1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因棉花再生株的獲得Fig.1 Regeneration of cotton tissue cultures by Agrobacterium-mediated transformation注：A：農(nóng)桿菌浸染棉花下胚軸誘導(dǎo)愈傷；B：愈傷組織增殖；C：胚性愈傷分化幼苗；D：轉(zhuǎn)基因再生苗植株Note：A: Induction of cotton hypocotyl callus after Agrobacterium infection; B: Callus proliferation; C: Embryogenic callus differentiation seedlings; D: The regeneration of transgenic seedlings

2.2 再生植株外源基因的PCR檢測(cè)

對(duì)轉(zhuǎn)化出幼苗并嫁接成活的再生株系提取基因組DNA，用特異性引物進(jìn)行片段檢測(cè)，PCR擴(kuò)增得到大小約710 bp的特異性條帶，該條帶與以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的片段大小吻合(圖2)。

圖2 部分轉(zhuǎn)基因棉花PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR analysis of partial transgenic cotton plantsM：DL2000 DNA Marker; P：質(zhì)粒Plasmid; +：陽(yáng)性 Positive；-：陰性 Negative

2.3 植株光合參數(shù)分析

與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)9、17、21、22凈光合速率均有不同程度增加，分別提高37.29%、34.09%、35.87%和26.99%；氣孔導(dǎo)度在各轉(zhuǎn)基因株系間差異不明顯，但比對(duì)照明顯降低；胞間CO2濃度均比對(duì)照降低，分別降低26.56%、14.63%、27.73%和24.56%；蒸騰速率較對(duì)照沒(méi)有顯著差異(表2)。

表2 田間光合特性測(cè)定Table 2 Determination of photosynthetic parameters of different plants

注:同列不同小寫字母表示差異極顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different lowercase letters show significant difference at the 0.05 level in the same column. The same below.

2.4 植株表型及干物質(zhì)積累變化

通過(guò)轉(zhuǎn)入外源基因在植物體內(nèi)建立光呼吸支路有望減少能量消耗，預(yù)期株型高大，生物量增加[12]。試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系明顯株高增加，葉片變大(圖3)。編號(hào)9和21的株高與對(duì)照有顯著差異，分別增加16.18% 和13.53%，編號(hào)17和22與對(duì)照顯著性較弱，分別增加12.47% 和10.07%(表3)。植株果枝數(shù)和總?cè)~片數(shù)與對(duì)照比較，均無(wú)顯著差異。葉片鮮重和干重比CK有不同程度增加，鮮重較CK分別增加21.59%、43.89%、44.25%和29.71%；干重比CK分別增加11.86%、17.79%、17.47% 和11.06%(表4)。

圖3 田間表型鑒定Fig.3 Phenotypic identification in the field

3 討論與結(jié)論

C3植物和C4植物由于葉片組織結(jié)構(gòu)不同，其光合作用存在不同的碳固定機(jī)制。C4植物中Rubisco羧化性高于氧化性使其光呼吸程度大幅減弱，光合效率顯著提高[6, 18]。 抑制植物光呼吸來(lái)提高光合效率一直是作物高產(chǎn)研究的重點(diǎn)，但單純抑制光呼吸并未有效提高光合效率，完全抑制光呼吸甚至?xí)怪参镏滤繹19～22]。研究者們將細(xì)菌體內(nèi)的乙醇酸代謝途徑引入擬南芥[12]中建立光呼吸支路，抑制其光呼吸速率，提高了光合效率，且獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥株型明顯變大，葉面積增加，鮮重和干物質(zhì)均顯著增加。將該代謝途徑導(dǎo)入馬鈴薯[13]中建立光呼吸支路，乙醇酸脫氫酶活性高的轉(zhuǎn)基因株系不僅株型變大，可溶性糖等能量物質(zhì)積累顯著增多，馬鈴薯塊莖的產(chǎn)量也明顯增加。利用相似思路在亞麻薺[14]中建立光呼吸支路，轉(zhuǎn)基因株系也實(shí)現(xiàn)了光呼吸減弱和光合效率增強(qiáng)，且轉(zhuǎn)基因亞麻薺葉面積變大，油料種子的產(chǎn)量明顯增加，氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量也明顯增多?？梢?jiàn)把細(xì)菌乙醇酸代謝途徑導(dǎo)入C3植物中構(gòu)建光呼吸支路，可使其光呼吸能量消耗減少，間接提高光合效率，對(duì)植物株型、葉面積等產(chǎn)生較大的影響，使植物生物量明顯增加。

表3 田間性狀調(diào)查統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistical analysis of traits in the field

表4 葉片鮮重與干重測(cè)定/gTable 4 Determination of fresh and dry weight of leaves

棉花作為C3植物，光合效率受光呼吸影響較嚴(yán)重，通過(guò)上述途徑改變其光呼吸途徑來(lái)減弱光呼吸是提高其光合作用率及產(chǎn)量的一種有效辦法。本研究將GDH導(dǎo)入棉花受體中，用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在棉花植株中構(gòu)建光呼吸支路。試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株凈光合效率均比對(duì)照提高，而氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度比對(duì)照降低，推測(cè)光呼吸支路在胞內(nèi)產(chǎn)生CO2使Rubisco羧化活性增強(qiáng)，胞間CO2被利用導(dǎo)致其濃度降低，而氣孔導(dǎo)度降低進(jìn)一步阻止了胞間CO2濃度的增加。田間轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出株高增加，葉片增大特征，同時(shí)葉片干物質(zhì)積累也有顯著差異。而果枝數(shù)和總?cè)~片數(shù)較對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，這暗示該基因抑制光呼吸減少消耗的能量更多積累到莖干和葉片上使植株高大，而非生長(zhǎng)出新葉、新果枝。但田間觀察部分轉(zhuǎn)基因株系盛鈴期仍有較多花蕾出現(xiàn)，由此推測(cè)該基因的導(dǎo)入可能對(duì)棉花生殖生長(zhǎng)期有影響，需從全生育期角度進(jìn)一步研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)基因材料出現(xiàn)高低分離情況，但由于獲得轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量有限，因此不能直觀判斷是否符合孟德?tīng)栠z傳分離比，也需要進(jìn)一步加代獲得純合株系進(jìn)行深入研究。

本研究將乙醇酸脫氫酶GDH基因?qū)腙懙孛奘荏w，成功獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株，并通過(guò)分子檢測(cè)篩選出36株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)田間表型鑒定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較對(duì)照凈光合效率提高，株高增加、葉片增大、葉片干物質(zhì)積累增多。本研究初步探索了一條通過(guò)抑制棉花光呼吸來(lái)提高光合效率及植株生物量的方法，為今后培育新型高光效棉花及擴(kuò)充高產(chǎn)棉花種質(zhì)資源庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。