謝 洋，李 鵬，隋 新，付 東，張曉臣

黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱 150068

細(xì)葉杜香(LedumpalustreL.)，別名白山苔、喇叭茶、狹葉杜香等，小型常綠灌木，杜鵑花科杜香屬植物，主要分布于歐洲北部和中部，亞州北部及北美洲[1,2]。在我國，細(xì)葉杜香主要分布在大興安嶺地區(qū)，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%[3]，資源十分豐富。

杜香藥用植物在原蘇聯(lián)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被稱為杜香草，在十九世紀(jì)俄國本草中記載了杜香的醫(yī)療作用，即用帶葉與花的嫩枝制成浸劑或酊劑治療支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及百日咳[4]。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)葉杜香含有多種活性成分，如精油、黃酮、三萜、多糖、多酚、香豆素[5-7]等，具有止咳、平喘、化痰、抗菌消炎、增強(qiáng)免疫力[8,9]等藥理作用，可以應(yīng)用于化妝品、化工、食品及醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，俄羅斯及韓國的研究者們已經(jīng)將杜香提取物添加到食品中制作功能食品，如飲料、冰激淋、酸奶、罐頭、面條等?？梢姡畔憔邆涑蔀樾滦褪称饭δ芤蜃觼碓吹臐摿10]。隨著人們對(duì)自由基與健康、疾病的關(guān)系認(rèn)識(shí)的發(fā)展，具有抗氧化功能的天然產(chǎn)物得到了研究者們的關(guān)注。張喬會(huì)等[11]研究證明了杜香多糖具有良好的抗氧化活性及熱穩(wěn)定性；李雪等[12]研究發(fā)現(xiàn)杜香葉多糖體外抗氧化活性和抗肝癌細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)出量效關(guān)系趨勢(shì)。

響應(yīng)面優(yōu)化法是一種有效的統(tǒng)計(jì)和優(yōu)化方法，能夠用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)對(duì)提取工藝進(jìn)行較全面的分析，且優(yōu)化結(jié)果更加準(zhǔn)確，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域[13]。目前以響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)葉杜香抗氧化物質(zhì)的提取工藝尚未見報(bào)道。本研究以DPPH自由基清除率來確定提取物抗氧化效果，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化了提取工藝，得到了細(xì)葉杜香抗氧化物質(zhì)的得率、總黃酮及多酚含量，并以叔丁基對(duì)苯二酚為參照研究了其DPPH自由基清除能力及鐵氰化鉀還原能力。

1 材料與儀器

1.1 植物來源

細(xì)葉杜香枝葉于2017年4月采自黑龍江省加各達(dá)齊市，經(jīng)哈爾濱工業(yè)大學(xué)王振宇教授鑒定為杜鵑花科杜香屬細(xì)葉杜香。

1.2 試劑

無水甲醇、無水乙醇、異丙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、鐵氰化鉀、磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉、叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、蘆丁分析標(biāo)準(zhǔn)品(95%)、沒食子酸分析標(biāo)準(zhǔn)品(99%)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器

UV-2600紫外可見光分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)，HAD-E-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(北京恒奧德儀器儀表有限公司)，BS110s電子分析天平(德國Sartorius公司)，PPV-CTRL1-CE平行合成反應(yīng)儀(東京理化器械株式會(huì)社)，HBM-103流水式粉碎機(jī)(瀚博機(jī)電有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取溶劑的篩選

將干燥后的細(xì)葉杜香粉碎后過60目篩為樣品，分別取5.0 g樣品加入反應(yīng)瓶中，再分別加入100 mL無水乙醇、60%乙醇、30%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、水，瓶口接冷凝裝置，置于60 ℃的平行反應(yīng)器中，攪拌浸提5 h，過濾，測定其DPPH自由基清除率。

2.2 抗氧化效果測定方法

本試驗(yàn)采用DPPH自由基清除能力來確定抗氧化效果。將2.1實(shí)驗(yàn)所得的多種提取物用甲醇稀釋至一定濃度后，取3 mL于具塞試管中，加入3 mLDPPH甲醇溶液(DPPH濃度為2×10-4mol/L)，搖勻，30 min后用分光光度計(jì)在517 nm處測定吸光度Aa；同時(shí)測定3 mL稀釋好的提取液加入3 mL甲醇混合后的吸光度Ab；以及3 mL DPPH溶液加入3 mL甲醇混合后的吸光度A0。按上述方法測定其DPPH清除率。對(duì)自由基清除率的計(jì)算方法如式(1)。

(1)

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間

稱取細(xì)葉杜香葉粉末5.0 g加入反應(yīng)瓶中，料液比為1∶30，置于平行反應(yīng)器中，瓶口接冷凝裝置，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間分別為1、3、5、7、10 h，提取次數(shù)1次，過濾，測定DPPH自由基清除率。

2.3.2 提取溫度

稱取細(xì)葉杜香葉粉末5.0 g加入反應(yīng)瓶中，料液比為1∶30，置于平行反應(yīng)器中，瓶口接冷凝裝置，提取溫度分別為40、50、60、70、80、90 ℃，提取時(shí)間3 h，提取次數(shù)1次，過濾，測定DPPH自由基清除率。

2.3.3 料液比

稱取細(xì)葉杜香葉粉末5.0 g加入反應(yīng)瓶中，分別加入不同體積的異丙醇，使料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，置于平行反應(yīng)器中，瓶口接冷凝裝置，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間3 h，提取次數(shù)1次，過濾，測定DPPH自由基清除率。

2.3.4 提取次數(shù)

稱取細(xì)葉杜香葉粉末5.0 g加入反應(yīng)瓶中，料液比為1∶30，置于平行反應(yīng)器中，瓶口接冷凝裝置，提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間3 h，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次，過濾，合并提取液，將提取液濃縮至相同體積，測定DPPH自由基清除率。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)細(xì)葉杜香異丙醇提取物DPPH自由基清除率影響顯著的因素，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以其DPPH自由基清除率為響應(yīng)值(Y)，以提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、液料比(C)為實(shí)驗(yàn)因素，利用Design Expert.8.0.5軟件處理數(shù)據(jù)，采用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析。

2.5 總黃酮及多酚含量測試

總黃酮測試方法參照文獻(xiàn)[14]，多酚含量測試方法參照文獻(xiàn)[15]。

2.6 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將得到的提取液進(jìn)行濃縮、干燥、備用。

2.6.1 DPPH自由基清除能力試驗(yàn)

配制待測樣品質(zhì)量濃度為0.01～0.32 mg/mL。按2.2測試方法進(jìn)行試驗(yàn)，TBHQ為對(duì)照組。

2.6.2 還原能力試驗(yàn)

配制待測樣品質(zhì)量濃度為0.01～0.32 mg/mL。測試方法參照文獻(xiàn)[16]并略有改動(dòng)。分別取待測樣品1 mL加入2.5 mL 0.2 mol/L pH為6.6的緩沖溶液和2.5 mL(1%，w/w)的鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min，加入2.5 mL(10%，w/w)的三氯乙酸，離心(3 000 rpm，10 min)，取上清液2.5 mL加入另一試管，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL(0.1%，w/w)三氯化鐵，10 min后測其在700 nm處的吸光度，TBHQ為對(duì)照組。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)3次，取平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差作為最終的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Origin 9.1及SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 溶劑篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各種溶劑的細(xì)葉杜香提取液顏色及DPPH自由基清除率結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，不同的提取溶劑得到的提取液從顏色到抗氧化效果都有明顯的差異，其中石油醚提取液抗氧化效果最差，異丙醇提取液抗氧化效果最好。經(jīng)Duncan極差法比較結(jié)果表明，在0.01%水平，以異丙醇為溶劑得到的細(xì)葉杜香提取液抗氧化效果最好，其次是無水乙醇，60%乙醇、30%乙醇與去離水差異不明顯，石油醚為最差；在0.05%水平，仍然是異丙醇提取液抗氧化效果最好，且與其他溶劑有極顯著差異，因此，本試驗(yàn)選用異丙醇作為最佳提取溶劑。

表1 不同溶劑的細(xì)葉杜香提取液顏色、DPPH自由基清除率結(jié)果

注：采用Duncan極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，相同大寫字母表示在0.01%水平差異不顯著，相同小寫字母表示在0.05%水平不顯著。

Note:Duncan’s Multiple Range Test.The same capital letter is not significant at 0.01% level,and the same small letter is not significant at 0.05% level.

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 提取時(shí)間

提取時(shí)間對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，抗氧化效果隨著隨著提取時(shí)間由1 h增加到3 h時(shí)，提取物的DPPH自由基清除率有明顯的上升。隨著時(shí)間的延長，提取物DPPH自由基清除率開始下降，到7 h后又開始增加，這可能是由于提取時(shí)間的延長會(huì)導(dǎo)致熱敏性物質(zhì)的分解，但隨著提取時(shí)間的增加又有新的抗氧化物質(zhì)溶出使DPPH自由基清除率增加?？紤]到提取時(shí)間過長會(huì)增加能耗，因此選擇2、3、4 h三個(gè)時(shí)間為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。

3.2.2 提取溫度

提取溫度對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，在提取溫度由40 ℃增加至60 ℃時(shí)，隨著提取溫度的增加DPPH自由基清除率明顯增加，在提取溫度為60～70 ℃時(shí)自由基清除率變化不明顯，隨后隨著溫度的增加自由基清除率降低，這可能是由于溫度升高導(dǎo)致熱敏性物質(zhì)分解造成的。因此，選擇55、65、75 ℃為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。

圖1 提取時(shí)間對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of extraction time on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

圖2 提取溫度對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.2.3 料液比

料液比對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，在料液比為1∶20時(shí)DPPH自由基清除率達(dá)到最高，而后隨著液料比的增加清除率降低，這可能是因?yàn)榱弦罕鹊脑黾釉斐闪瞬糠挚寡趸镔|(zhì)的分解，引起了DPPH自由基清除率的下降。因此，選擇料液比為1∶10、1∶20、1∶30為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。

圖3 料液比對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.2.4 提取次數(shù)

提取次數(shù)對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，隨著提取次數(shù)增加，DPPH自由基清除率逐漸增加，提取4次時(shí)清除率最高，但是增加幅度較少，綜合考慮溶劑及能源消耗，選擇提取次數(shù)為1次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)細(xì)葉杜香提取物DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of extraction times on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.3.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼如表2所示，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

3.3.2 二次回歸模型擬合及方差分析

利用Design Expert.8.0.5軟件對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得回歸模型方差分析及顯著性結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型方差分析及顯著性結(jié)果

注：**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)，○表示差異不顯著(P>0.05)。

Note:** ,*indicated extremely significant difference, significant difference,respectively.○ respresented not significant.

利用Design-Expert 8.0.5軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=84.31+0.25×A+0.45×B+0.098×C-0.038×A×B-7.500E-003×A×C+0.027×B×C-0.36×A2-0.57×B2-0.16×C2

由方差分析可以看出：模型P<0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P>0.05，說明該模型擬合度好；擬合度R2=0.985 8，表明回歸方程對(duì)Y的預(yù)測值與實(shí)際值有較好的相關(guān)性，該模型能解釋98.58%響應(yīng)值的變化，實(shí)驗(yàn)誤差小。在一次項(xiàng)的檢驗(yàn)中，自變量A、B極顯著，自變量C顯著；各變量的交互項(xiàng)均不顯著；二次項(xiàng)檢驗(yàn)均達(dá)到極顯著。

各交互作用對(duì)細(xì)葉杜香提取液DPPH自由基清除率影響結(jié)果如圖5所示。一般來說，在響應(yīng)面圖中響應(yīng)面坡度越陡峭則響應(yīng)值越敏感。從圖中可以看出提取溫度與提取時(shí)間及料液比的曲線均較陡峭，說明提取溫度對(duì)DPPH自由基清除率影響最為顯著。

圖5 各交互作用對(duì)細(xì)葉杜香提取液DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots showing interaction of the factors on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化后，得到的最佳提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間3.33 h、提取溫度68.94 ℃、料液比為1∶23.26，此時(shí)DPPH自由基清除率預(yù)測值為84.45%。為方便實(shí)際操作，修正工藝參數(shù)為提取時(shí)間3.3 h、提取溫度69 ℃、料液比為1∶23，經(jīng)過三次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，DPPH自由基清除率為84.37±0.17%，與實(shí)驗(yàn)預(yù)測值接近，證明回歸模型較為準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。按此工藝參數(shù)進(jìn)行提取，將得到的提取液進(jìn)行濃縮、干燥后，計(jì)算出細(xì)葉杜香抗氧化物質(zhì)的得率為4.68±0.24 g/100 g原料。

3.4 總黃酮及多酚含量

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的擬合方程Y=0.551 86X+0.001 9，R2=0.999 8，線性關(guān)系良好。

沒食子酸的擬合回歸方程為Y=0.565 29X-0.002 37，R2=0.999 5，線性關(guān)系良好。

經(jīng)計(jì)算，細(xì)葉杜香提取物中總黃酮含量為236.17±2.16 mg/g蘆丁當(dāng)量，多酚含量為73.97±3.18 mg/g沒食子酸當(dāng)量。經(jīng)報(bào)道，多酚及黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗衰老等作用，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)[17]?？梢?，提取物中總黃酮及多酚含量較高，可能是其具有較好抗氧化活性的原因。

3.5 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.5.1 DPPH自由基清除能力

細(xì)葉杜香抗氧化提取物和TBHQ對(duì)DPPH自由基清除能力結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，細(xì)葉杜香抗氧化提取物具有較好的抗氧化性，且在一定范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基清除能力會(huì)隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，其半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.033 mg/mL，TBHQ IC50為0.009 7 mg/mL。

圖6 細(xì)葉杜香提取物和TBHQ對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Ledum palustre L.extracts and TBHQ

3.5.2 還原能力

還原能力的測定可以檢測樣品是否是良好的電子供體。還原力強(qiáng)的物質(zhì)可以提供更多的電子，除了使三價(jià)鐵離子還原為二價(jià)鐵離子外，還可與自由基結(jié)合，使自由基形成穩(wěn)定的物質(zhì)。細(xì)葉杜香抗氧化提取物和TBHQ對(duì)鐵氰化鉀的還原能力結(jié)果如圖7所示。從圖中可以看出，在樣品質(zhì)量濃度為0～0.32 mg/mL內(nèi)對(duì)鐵氰化鉀還原能力呈線性增加，且線性關(guān)系良好，證明細(xì)葉杜香提取物具有一定的鐵氰化鉀還原能力。

圖7 細(xì)葉杜香提取物和TBHQ對(duì)鐵氰化鉀的還原能力Fig.7 Reducing power of Ledum palustre L.extracts and TBHQ on potassium ferricyanide

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先通過溶劑篩選，利用Ducan極差法比較得到最佳提取溶劑為異丙醇。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面優(yōu)化了細(xì)葉杜香抗氧化物質(zhì)的提取工藝參數(shù)，結(jié)果表明，對(duì)細(xì)葉杜香提取液DPPH自由基清除率影響最大的因素是提取溫度，其次是提取時(shí)間，料液比對(duì)其影響相對(duì)較小。結(jié)合實(shí)際操作，確定了最佳提取工藝條件為提取時(shí)間3.3 h、提取溫度69 ℃、料液比為1∶23，在該條件下提取液的DPPH自由基清除率為84.37±0.17%，抗氧化物質(zhì)的得率為4.68±0.24 g/100 g，總黃酮含量為236.17±2.16 mg/g，多酚含量為73.97±3.18 mg/g。

抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)葉杜香提取物抗氧化性能較強(qiáng)，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，提取物對(duì)DPPH自由基清除作用呈現(xiàn)量效關(guān)系，IC50為0.033 mg/mL；鐵氰化鉀還原能力結(jié)果表明隨著提取物質(zhì)量濃度增加對(duì)鐵氰化鉀還原能力呈線性增加。若能對(duì)其中的活性成分進(jìn)行分離純化，則能有效提高其抗氧化活性，并且為其成為應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域的新型天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。