劉新磊，王珊珊，顏月香，陳福蓮

(濰坊市益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500)

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)展為終末期腎病的共同途徑，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)成分在間質(zhì)內(nèi)過度沉積和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，從而引起腎結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失[1-2]。腎間質(zhì)纖維化是決定CKD發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的重要因素，早期治療甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對阻止CKD進(jìn)展具有重要意義。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，具有高度的保守性，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、功能調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。研究表明miRNAs在腎臟細(xì)胞組織發(fā)育、腎功能及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著極其重要的作用[3]。在伴有腎纖維化的CKD動物模型或者患者腎組織中存在大量異常表達(dá)的miRNAs，可能參與了腎纖維化的發(fā)生進(jìn)展[4]。miR-192是腎特異性表達(dá)的miRNAs之一，在多種急慢性腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中異常表達(dá)[5-6]。研究顯示miR-192與多種慢性疾病造成的器官纖維化密切相關(guān)，在肝[7]、皮膚瘢痕[8]、心臟[9]、腹膜[10]等器官纖維化組織中表達(dá)明顯異常，可能參與了器官纖維化的進(jìn)程。目前有關(guān)miR-192與腎間質(zhì)纖維化關(guān)系的研究較少，并且具體作用機制尚不明確。本研究中我們通過建立經(jīng)典的腎間質(zhì)纖維化動物模型-單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstmction,UUO)大鼠模型，探討miR-192在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)變化及其下調(diào)miR-192對大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響和可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠45只，鼠齡6周，體重190 ～ 240 g，購自山東大學(xué)動物實驗中心[SCXK (魯) 2017-0009]。常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境[SYXK (魯) 2014-0008]1周。本研究整個實驗過程中嚴(yán)格按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷[IACUC NO.2016-23]。

1.2 主要試劑與儀器

尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)測定試劑盒購自瑞士羅氏公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR (qRT-PCR) 試劑盒購自大連寶生物工程公司；miR-192抑制劑antagomir-192及全部PCR引物均購自廣州銳博生物公司； Masson 染色試劑盒購自福州邁新生物公司；一抗兔抗鼠鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)及I型膠原蛋白(collagen I)、 GAPDH抗體均購自美國Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物公司。LightCycle 96 熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；7100型日立全自動生化分析儀購自日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及模型建立

SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周后，所有SD大鼠按隨機分為手術(shù)組、模型組、antagomir-192組，每組15只。模型組和antagomir-192組參考文獻(xiàn)的方法[11-12]建立腎間質(zhì)纖維化動物模型-UUO大鼠模型，方法簡述如下：大鼠麻醉成功后于左側(cè)肋緣下脊柱旁開1.5 cm處切開腹腔分離暴露左腎，游離左側(cè)近腎盂端輸尿管，于靠近腎門處和輸尿管上1/3水平分別以4-0號絲線結(jié)扎輸尿管后離斷輸尿管，縫合腹腔。假手術(shù)組麻醉成功后僅切開腹腔暴露左腎，游離左側(cè)近腎盂端輸尿管，但不結(jié)扎和離斷輸尿管。術(shù)后第1、7、14天antagomir-192組大鼠給予antagomir-192(30 mg/kg)尾靜脈注射，而假手術(shù)組和模型組大鼠給予等量生理鹽水尾靜脈注射,術(shù)后第21天麻醉處死所有SD大鼠，取大鼠左側(cè)腎組織，留取一部分腎組織置于4%多甲醛溶液中固定，用于病理切片染色；剩余左腎組織經(jīng)液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于提取mRNA及蛋白。

1.3.2 qRT-PCR檢測各組大鼠腎組織miR-192的表達(dá)

取凍存腎組織，TRIzol法提取腎組織中總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度。取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，用miR-192引物參照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR體系后進(jìn)行PCR反應(yīng), 引物序列：miR-192上游引物：5′-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內(nèi)參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，45個循環(huán)后結(jié)束。以U6作為miR-192的內(nèi)參基因，miR-192的相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.3.3 各組大鼠血清BUN和Cr水平的檢測

麻醉處死大鼠后心臟取血2 mL，以3000 r/min，離心半徑15 cm離心15 min取上清液，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清BUN和Cr的水平。

1.3.4 各組大鼠腎組織HE染色和Masson染色

取多聚甲醛固定的腎組織，酒精脫水、二甲苯透明，石蠟浸潤包埋后，切片機制作4 μm厚石蠟切片，45℃恒溫箱烘干，再將切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、浸泡等常規(guī)處理后進(jìn)行HE或Masson染色，光鏡下觀察腎組織的病理學(xué)改變。HE染色：蘇木精染色5 min，1%鹽酸酒精和1%氨水酒精分色，蒸餾水沖洗后，1%伊紅染色3 min，酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。參考文獻(xiàn)進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷評分[12], 評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，腎小球無病變；1分，腎小球病變范圍<25%；2分，腎小球病變范圍25%～50%；3分，腎小球病變范圍51%～75%；4分，腎小球病變范圍>75%。Masson染色：Masson染液染色5 min，以醋酸洗液沖洗3遍，再以磷鎢酸染色7 min，醋酸洗液沖洗3遍，甲苯胺藍(lán)染色2 min，以醋酸洗液沖洗3遍后，酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。參考文獻(xiàn)的方法[13]計算腎間質(zhì)膠原纖維沉積率：每張切片隨機選取10個腎小管間質(zhì)不相重疊的視野，藍(lán)色為Masson陽性染色區(qū)(纖維化區(qū))，應(yīng)用Image Pro plus 圖像分析軟件進(jìn)行圖像面積分析，腎間質(zhì)膠原纖維沉積率=陽性染色區(qū)面積/腎間質(zhì)總面積 × 100%。

1.3.5 Western blotting檢測各組大鼠腎組織E-cadherin、α-SMA、vimentin及collagen I蛋白的表達(dá)

RIPA裂解液提取各組大鼠腎組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。蛋白上樣進(jìn)行SDS-Page電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗(E-cadherin、α-SMA、vimentin、collagen I及GAPDH抗體),搖床4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次后，ECL顯像曝光。采集圖像用Quality One進(jìn)行條帶灰度值測定，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織中miR-192的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果如圖1所示：假手術(shù)組、模型組、antagomir-192組大鼠腎組織中miR-192的相對表達(dá)水平分別為(1.04±0.04)、(7.41±0.39)、(1.45±0.17)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織miR-192的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，antagomir-192組大鼠腎組織miR-192的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

2.2 各組大鼠腎功能檢測

各組大鼠血清BUN和Cr檢測結(jié)果如表1所示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN、Cr水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，antagomir-192組大鼠血清BUN和Cr明顯下降(P<0.05)。

圖1 qRT-PCR檢測各組大鼠腎組織miR-192的表達(dá)Figure 1 qRT-PCR detection of the expression of miR-192 in renal tissues of rats in each group

2.3 各組大鼠腎間質(zhì)損傷評分及腎間質(zhì)膠原纖維沉積率

HE染色結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)未見明顯損傷表現(xiàn)；模型組大鼠腎可見腎小管管腔明顯閉塞或擴張，間質(zhì)增寬，腎間質(zhì)大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤；antagomir-192組大鼠病理性改變較模型組明顯減輕。各組大鼠腎間質(zhì)損傷評分如表2所示：模型組大鼠腎間質(zhì)損傷評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而antagomir-192組大鼠腎間質(zhì)損傷評分明顯低于模型組(P<0.05)。

Masson染色結(jié)果如圖3所示，腎間質(zhì)膠原纖維沉積率結(jié)果如表2顯示：模型組大鼠腎間質(zhì)膠原纖維沉積率明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，而antagomir-192組大鼠腎間質(zhì)膠原纖維沉積率明顯低于模型組(P<0.05)。

表1 各組大鼠腎功能比較

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the sham group,#P<0.05.Compared with the model group,*P<0.05.

圖2 大鼠腎組織的病理學(xué)改變(HE染色，× 200)Figure 2 Pathological changes in the rat renal tissues.HE staining

圖3 大鼠腎組織的病理學(xué)改變(Masson染色， × 200)Figure 3 Pathological changes of the rat renal tissues. Masson staining

表2 各組大鼠腎間質(zhì)損傷評分及腎間質(zhì)膠原纖維沉積率比較

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the sham group,#P<0.05.Compared with the model group,*P<0.05.

2.4 各組大鼠腎組織中E-Cadherin、α-SMA、Vimentin及Collagen I蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示：模型組大鼠腎組織中E-cadherind蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低(P<0.05)，α-SMA、vimentin及collagen I蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)；而antagomir-192組大鼠腎組織中E-cadherind蛋白表達(dá)較模型組明顯升高(P<0.05)，α-SMA、vimentin及collagen I蛋白的表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.05)。(見圖4)。

圖4 Western blotting檢測E-cadherin、α-SMA、vimentin及collagen I蛋白的表達(dá)Figure 4 Western blotting results of the expression of E-cadherin,α-SMA, vimentin, and collagen I proteins

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是CKD進(jìn)展至終末期腎病的最終結(jié)局，是多種細(xì)胞因子和信號通路參與的復(fù)雜的過程，迄今為止，其具體發(fā)生進(jìn)展機制尚未完全清楚，并且臨床上仍缺乏能夠有效阻滯或者延緩腎間質(zhì)纖維化的有效治療方法[14]。近年來研究顯示miRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、疾病的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，并且在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮著一定的作用[15-17]。

miR-192是腎特異性表達(dá)的miRNAs之一，近期其與急慢性腎臟疾病及器官纖維化的關(guān)系受到人們的廣泛關(guān)注[5-10]。UUO動物模型是目前研究腎纖維化發(fā)病機制、腎細(xì)胞分化以及評價腎纖維化治療方法的理想的動物模型[18]。為了研究miR-192與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系。本研究中我們通過UUO建立腎纖維化大鼠模型。研究結(jié)果顯示模型組大鼠血清BUN、Cr水平較假手術(shù)組明顯升高，腎組織HE染色結(jié)果顯示模型組大鼠腎可見腎小管管腔明顯閉塞或擴張，間質(zhì)增寬，腎間質(zhì)大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，而假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)未見明顯損傷表現(xiàn)，模型組大鼠腎間質(zhì)損傷評分及腎間質(zhì)膠原纖維沉積率明顯高于假手術(shù)組，以上提示本研究中UUO大鼠模型造模成功。進(jìn)一步我們通過qRT-PCR檢測大鼠腎組織中miR-192表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織中miR-192表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯升高，提示miR-192在腎間質(zhì)纖維化中可能發(fā)揮著重要的作用。為了進(jìn)一步驗證miR-192在腎間質(zhì)纖維化中的作用，我們通過尾靜脈給予UUO大鼠注射miR-192抑制劑antagomir-192，成功下調(diào)了UUO大鼠腎組織中miR-192的表達(dá)水平，結(jié)果顯示antagomir-192組大鼠血清BUN和Cr水平明顯降低，病理性改變較模型組明顯減輕，并且腎間質(zhì)損傷評分和腎間質(zhì)膠原纖維沉積率也明顯降低，提示下調(diào)miR-192能夠抑制UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化。

近年來隨著對器官纖維化的研究深入發(fā)現(xiàn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在包括腎在內(nèi)的眾多器官纖維化過程中發(fā)揮著重要的作用[19]。在EMT的過程中，上皮表型特征標(biāo)志物如E-cadherin等表達(dá)下調(diào)，上皮細(xì)胞極性消失及黏附性降低，間充質(zhì)表型特征標(biāo)志物vimentin及α-SMA 等上調(diào)，并伴有collagen I蛋白等基質(zhì)組分表達(dá)增加[20]。Iwano等[21]在對UUO大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，在腎間質(zhì)纖維化中，新形成的成纖維細(xì)胞大部分來源于EMT。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎組織中E-cadherind蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，α-SMA、vimentin及collagen I蛋白的表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，提示EMT在UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化中也起著重要的作用。近年來研究顯示miR-192在EMT的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[22-23]。但miR-192在腎間質(zhì)纖維化中的作用是否也是通過調(diào)控EMT來實現(xiàn)的尚不清楚。本研究中我們發(fā)現(xiàn)antagomir-192組大鼠腎組織中E-cadherind蛋白表達(dá)較模型組明顯升高，α-SMA、vimentin及collagen I蛋白的表達(dá)較模型組明顯降低,提示下調(diào)miR-192對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的保護作用可以通過調(diào)控EMT來實現(xiàn)。

綜上所述，miR-192在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中表達(dá)升高，下調(diào)miR-192可能能夠通過調(diào)控EMT抑制UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化從而起到保護作用，從而為腎纖維化的治療提供新的研究方向。