何鳳儀，王 弋，羅艷華，金海燕，鄺少松*

(1. 廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣州 510260；2. 廣東省醫(yī)學實驗動物中心，廣東 佛山 528248)

桂枝茯苓丸出自東漢醫(yī)學家張仲景《金匱要略·婦人妊娠病篇》，是婦科常用方劑。具有活血、化瘀、消癥之功，在臨床上主要用于治療婦女瘀血阻絡所致癥塊、經(jīng)閉、子宮肌瘤、慢性盆腔炎包塊、痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥等癥狀[1-2]?，F(xiàn)代藥理學研究顯示，桂枝茯苓丸所含桂枝、牡丹皮、桃仁、赤芍和茯苓 5 味中藥中的很多活性成分均具有免疫調(diào)節(jié)的作用[3-5]。本文通過研究桂枝茯苓湯對HEC-1-B子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠的影響，并為進一步的研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

4 ～ 5周齡，雌性，BALB/c裸小鼠，30只，實驗開始體重：13.3 ～ 14.7 g，SPF級，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK (粵) 2013-0002]，動物質(zhì)量合格證號：44007200044449。實驗地點為廣東省醫(yī)學實驗動物中心比較醫(yī)學實驗室[SYXK (粵) 2013-0002]，實驗證明編號：00179376。福利倫理審查證號：B201709-18，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞株

HEC-1-B人子宮內(nèi)膜癌細胞，提供單位：中國科學院細胞庫。細胞培養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心細胞室，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2，選用MEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清，1%雙抗。

1.2 主要試劑與儀器

藥物與配制：桂枝茯苓湯：由廣東一方制藥廠生產(chǎn)的中藥濃縮提取物中藥免煎配方顆粒制成，組方：桂枝顆粒：1.25 g、茯苓顆粒1.0 g、赤芍顆粒3.0 g、丹皮顆粒1.8 g、桃仁顆粒3.0 g、甘草顆粒1.67 g。試驗前稱取中藥配方顆粒加開水使其充分溶解，配制成所需濃度的桂枝茯苓湯?？ㄣK注射液：齊魯制藥(海南)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：BB2J7009，給藥前用5%葡萄糖注射液稀釋至所需濃度。

主要試劑：MEM培養(yǎng)液，批號：8117148，Gibco；胎牛血清，批號：42F5353 K，Gibco；0.25% Trypsin-EDTA，批號：75030101100，Genview；青霉素/鏈霉素，批號：69230101100，Genview；PBS磷酸鹽緩沖劑，批號：60A1001200，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；一抗Caspase-3抗體，貨號：GB11009，Servicebio；一抗Bcl-2抗體，貨號：GB12008，Servicebio；二抗HRP標記山羊抗小鼠IgG，貨號：GB23301，Servicebio；組化試劑盒DAB顯色劑，貨號：G1211，Servicebio；二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸(PH6.0)抗原修復液，貨號：G1202，Servicebio；3%雙氧水，貨號：G0115，Servicebio；BSA，貨號：G5001，Servicebio；蘇木素染液，貨號：G1004，Servicebio；蘇木素分化液，貨號：G1309，Servicebio；蘇木素返藍液，貨號：G1340，Servicebio；中性樹膠，貨號：G1403，Servicebio。

主要儀器：游標卡尺，上海臺海工量具有限公司；電子天平，德國Sartorius，天平感量0.1 mg；脫水機，武漢俊杰電子有限公司，型號：JJ-12 J；包埋機，武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5；病理切片機，上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016；組織攤片機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，型號：KD-P；烤箱，上?；厶﹥x器制造有限公司，型號：DHG-9140 A；脫色搖床，Servicebio，型號：TSY-B；熒光顯微鏡，Olympus，型號：BX41。

1.3 實驗方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜癌皮下模型的建立

裸鼠檢疫合格后納入試驗，HEC-1-B細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化，臺盼蘭染色計數(shù)，用 PBS配成濃度為2×l07個/mL的細胞懸液，于30只裸鼠左側(cè)肩背部注細胞懸液，每次注射前需混勻細胞懸液(每只裸鼠200 μL，共計4×106細胞)。待腫瘤體積生長至約100 mm3～200 mm3時，選取腫瘤體積較均勻的18只模型動物隨機分為3組：模型對照組、卡鉑注射液組、桂枝茯苓湯組，6只/組。淘汰裸鼠采用頸椎脫臼處死。

1.3.2 給藥方法

模型對照組動物每天按0.2 mL/10 g體重灌胃給予去離子水，桂枝茯苓湯組動物每天按0.2 mL/10 g體重灌胃給予0.12 g/mL桂枝茯苓湯，每天1次，連續(xù)給藥21 d；卡鉑注射液組動物每天按0.1 mL/10 g體重腹腔注射給予2 mg/mL卡鉑注射液，每天1次，連續(xù)給藥5 d。

1.3.3 動物觀察

每天觀察動物的飲食情況、精神狀態(tài)、活躍程度、糞便情況，并進行記錄，每周稱量動物體重2次。

1.3.4 腫瘤體積及脾系數(shù)

從腫瘤成模后至實驗結(jié)束，每周測量2次腫瘤長短徑，繪制腫瘤生長曲線；腫瘤體積按公式： V=1/2ab2測量計算，a、b分別表示長和寬；相對腫瘤增殖率T/C(%)：針對每一種人癌異體移植瘤模型的抗腫瘤活性評價指標。計算公式如下：T/C%=TRTV / CRTV×100%。(TRTV：治療組RTV；CRTV：模型對照組RTV)。根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)，計算公式為： RTV=Vt / V0。其中V0為分籠給藥時(即d1)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。實驗結(jié)束后，取裸鼠脾臟稱重，以脾重比體重計算脾系數(shù)。

1.3.5 免疫組化

(1)石蠟切片脫蠟：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min,二甲苯Ⅱ15 min,二甲苯III 15 min,無水乙醇Ⅰ5 min,無水乙醇Ⅱ5 min,85%酒精5 min,75%酒精5 min,蒸餾水洗。

(2)抗原修復：組織切片置于盛滿檸檬酸(pH 6.0)抗原修復液的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復，中火10 min至沸，停火5 min保溫再轉(zhuǎn)中低火5 min，?；? min保溫再轉(zhuǎn)中低火5 min此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。

(3)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。

(4)血清封閉:在組化圈內(nèi)滴加3% BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。

(5)一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。

(6)二抗：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗(HRP標記)覆蓋組織，室溫孵育50 min。

(7)DAB顯色：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。

(8)復染細胞核：蘇木素復染3 min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。

(9)脫水封片：將切片依次放入75%酒精5 min,85%酒精5 min,無水乙醇Ⅰ5 min,無水乙醇Ⅱ5 min,二甲苯Ⅰ5 min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般臨床觀察

給藥期間，動物精神狀態(tài)良好，飲食情況、精神狀態(tài)、活躍程度、糞便情況均未見異常，模型對照組及桂枝茯苓湯組體重正常增加，卡鉑注射液組體重下降。見表1。

表1 桂枝茯苓湯對HEC-1-B子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠體重的影響

表2 桂枝茯苓湯對HEC-1-B子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠腫瘤的影響

注：與模型對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the model group,*P<0.05.

2.2 腫瘤體積

根據(jù)每周腫瘤測量情況，繪制腫瘤生長曲線圖。卡鉑注射液組腫瘤相對增值率為58.2%；桂枝茯苓湯組腫瘤相對增值率為67.3%；與模型對照組比較，卡鉑注射液組和桂枝茯苓湯組腫瘤體積均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3 脾系數(shù)

與模型對照組比較，桂枝茯苓湯組脾系數(shù)略有增加，卡鉑注射液組脾系數(shù)顯著降低(P<0.01)，見表3。

2.4 免疫組化結(jié)果

2.4.1 Bcl-2表達

模型對照組顏色較深，表明腫瘤組織中Bcl-2蛋白表達較多，桂枝茯苓湯組和卡鉑組腫瘤組顏色較淺，表明腫瘤組織中Bcl-2蛋白表達較少。見圖1。

2.4.2 Caspase-3表達

模型對照組顏色較淺，表明腫瘤組織中caspase-3表達較少，桂枝茯苓湯組和卡鉑組腫瘤組顏色較深，表明腫瘤組織中caspase-3表達較多。見圖2。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤，是最常見的婦科惡性腫瘤之一，并且近年來在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢[6]。早期患者以手術治療為主，晚期或復發(fā)患者需以化療提高治療效果[7-8]，然而反復化療在抗癌的同時也帶來了嚴重的毒副作用，降低機體免疫力，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[9-12]。因此，抗癌效果好，且毒副作用低的治療藥物一直是研究熱點。

在本實驗研究中，卡鉑注射液組相對腫瘤增值率為58.2%，桂枝茯苓湯組相對腫瘤增值率為67.3%，兩組腫瘤體積較模型對照組顯著減小，表明桂枝茯苓湯及卡鉑注射液對子宮內(nèi)膜癌具有抑制的效果；同時桂枝茯苓湯組動物體重正常增加，卡鉑注射液組動物體重有所下降，表明桂枝茯苓湯對裸鼠未見明顯毒性反應；脾臟稱量結(jié)果表明，卡鉑注射液組脾臟重量及脾系數(shù)較模型對照組顯著降低，桂枝茯苓湯組脾臟重量及脾系數(shù)較模型對照組未見顯著變化，表明桂枝茯苓湯未見免疫抑制效果。

表3 桂枝茯苓湯對HEC-1-B子宮內(nèi)膜癌荷瘤裸鼠脾系數(shù)的影響

注：與模型對照組比較，**P<0.01。

Note. Compared with the model group,**P<0.01.

哺乳動物細胞依賴 caspase 引發(fā)凋亡主要有3 條途徑[13]：死亡受體途徑(TNF/TNFR，F(xiàn)as/Fasl)、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑[14]。其中caspase-3是引起細胞凋亡的因子，本實驗中免疫組化結(jié)果表明桂枝茯苓湯組腫瘤組織caspase-3表達高于模型對照組腫瘤組織，表明桂枝茯苓湯具有促進子宮內(nèi)膜癌凋亡的功效。同時，Bcl-2 作為凋亡蛋白Bcl-2 家族成員，在無外界凋亡刺激時，具有抑制凋亡作用，當 Bcl-2 高表達時，細胞凋亡被抑制[15-16]。本實驗得到的模型對組腫瘤組織中 Bcl-2 蛋白表達水平較桂枝茯苓湯組較高，表明Bcl-2 蛋白表達水平的變化可能是桂枝茯苓湯可以抑制腫瘤生長，促進腫瘤凋亡的分子機制。本研究將進一步從細胞、分子水平來闡述桂枝茯苓湯的作用機制，為其臨床應用提供更充足的依據(jù)。