周東月，王春璐，任艷平，宋 伍，劉 智，姜 爽*，郭 焱*

(1. 長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117；2. 長春中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，長春 130117；3. 修正藥業(yè)集團長春高新制藥有限公司，長春 130021)

黃連是傳統(tǒng)中藥材之一，為毛茛科植物，具有抗糖尿病、抗癌及抗炎等多種藥理作用，應用廣泛[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，以黃連為主要成分的黃連解毒湯可以通過調控血糖，下調caspase-3、p38MAPK、TGF-β1的表達及降低氧化應激的水平，發(fā)揮保護DN大鼠損傷作用[3]。此外，黃連中的活性成分黃連素也可以通過改善胰島素抵抗、抑制氧化應激反應、降低糖基化終末產物的含量等機制，改善早期DN患者血管內皮功能，從而發(fā)揮對腎的保護作用[4]。本課題組的前期工作也證實，黃連中的水溶性成分黃連多糖(CCPW)具有較好的抗糖尿病和改善胰島素抵抗作用[5-6]。鑒于以上原因，并充分考慮氧化應激及炎癥反應在糖尿病腎病進展中的重要作用，本研究以鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導的糖尿病模型大鼠為研究對象，在明確黃連多糖具有減輕腎損傷作用的基礎上，探討其對氧化應激和炎癥反應的影響，初步闡明作用機制，從而為黃連多糖的臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠100只，雄性、清潔級，8周齡，體質量(200 ± 20) g，購自吉林大學實驗動物中心[SCXK (吉) 2016-0001]，SD大鼠飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學凈月校區(qū)動物房內[SYXK (吉) 2018-0014]，飼養(yǎng)于光照12 h/12 h明暗交替、溫度(24 ± 2)℃、相對濕度70%條件下。本研究經長春中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準(審批號：2017011)，實驗期間按照3R原則給予實驗動物人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

黃連多糖由本實驗室自制[7]；STZ(純度>98%，批號0210055701，規(guī)格1 g)和氯沙坦鉀片(批號180624，規(guī)格100 mg)分別購于美國Sigma公司和默沙東公司；SOD(批號20180108)、CAT(批號20170418)、GSH-Px(批號20171219)、MDA(批號20170531)、IL-6(批號20180325)、hs-CRP(批號20171108)和TNF-α(批號20171022)檢測試劑盒由南京建成生物技術有限公司提供。QUINTIX224-1CN電子天平(德國賽多利斯公司)，B200 V全自動生化分析儀(南京英諾華公司)，XI5300熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，754紫外可見分光光度計(上海菁華公司)，Multiskan FC酶標儀(美國賽默飛世爾公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病模型建立、分組及給藥

SD大鼠適應環(huán)境1周后，糖尿病大鼠模型采用腹腔注射STZ(60 mg/kg)法建立。將建模成功的大鼠(血糖≥16.7 mmol/L)按體質量隨機分為模型組、d黃連多糖高(300 mg/kg/d)、低(100 mg/kg/d)劑量組及氯沙坦鉀組(30 mg/kg/d)，每組10只；另隨機選取SD大鼠10只作為正常組。糖尿病模型建立成功的第2 d灌胃給藥，1次/d；而模型組大鼠和正常組大鼠用等體積的生理鹽水灌胃，給藥持續(xù)8周。給藥期間記錄體質量變化情況。

1.3.2 血清Scr、BUN含量測定及24 h尿蛋白定量

給藥結束后，腹主動脈取血，離心分離血清，低溫保存?zhèn)溆茫灰徊糠盅宀捎萌詣由治鰞x檢測Scr和BUN水平，剩余血清用于測定IL-6、hs-CRP和TNF-α含量。代謝籠收集大鼠24 h尿液，尿蛋白定量采用考馬斯亮藍G-250法測定。

1.3.3 腎組織病理觀察

主動脈取血完成后，頸椎脫臼法處死大鼠，無菌分離腎組織；精確稱重并記錄；一部分腎組織用于SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量等抗氧化指標的測定，另一部分腎組織采用HE染色法觀察黃連多糖對腎組織病理改變的影響。

1.3.4 腎組織SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量檢測

取“1.3.3”中剩余腎組織，放在冰上，加入預冷至0℃的生理鹽水，比例為1∶10；充分研磨，離心，取上清液，制備10%腎組織勻漿液；采用分光光度法，按照SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量檢測試劑盒說明書的操作步驟進行檢測。

1.3.5 血清IL-6、hs-CRP和TNF-α含量檢測

取“1.3.2”中剩余血清，采用ELISA法，按照IL-6、hs-CRP和TNF-α含量檢測試劑盒說明書的操作步驟進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 黃連多糖對各組大鼠體質量與腎質量體質量比的影響

與正常組比較，從第2周開始，模型組大鼠體質量顯著降低(P<0.05)，這種趨勢一直持續(xù)到給藥結束；而腎質量體質量比顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，氯沙坦鉀組及黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠體質量均有不同程度的增加，從第6周開始，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而腎質量體質量比顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.2 黃連多糖對各組大鼠血清Scr、BUN含量及24 h尿蛋白定量的影響

模型組大鼠血清BUN、Scr含量及24 h尿蛋白定量均明顯升高，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；氯沙坦鉀組及黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠血清BUN、Scr含量及24 h尿蛋白定量均明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與氯沙坦鉀組比較，黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠血清BUN、Scr含量及24 h尿蛋白定量均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 黃連多糖對各組大鼠腎組織病理的影響

正常組大鼠腎未見明顯病理變化，組織結構清晰；模型組大鼠系膜細胞及系膜基質增生明顯，腎小球硬化，腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性；氯沙坦鉀組及黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠腎組織病理改變較模型組減輕。結果見圖1。

2.4 黃連多糖對各組大鼠腎組織SOD、CAT及GSH-Px活性及MDA含量的影響

模型組大鼠腎組織SOD、CAT及GSH-Px活性顯著降低，而MDA含量則明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；氯沙坦鉀組及黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠腎組織SOD、CAT及GSH-Px活性顯著升高，而MDA含量則明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與氯沙坦鉀組比較，黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠腎組織SOD及低劑量組CAT、GSH-Px活性顯著降低，而高劑量組、低劑量組MDA含量則明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 黃連多糖對各組大鼠體質量與腎質量體質量比的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯沙坦鉀組比較，&P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the losartan group,&P<0.05.

表2 黃連多糖對各組大鼠血清Scr、BUN含量及24 h尿蛋白定量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯沙坦鉀組比較，&P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the losartan group,&P<0.05.

表3 黃連多糖對各組大鼠腎組織SOD、CAT及GSH-Px活性及MDA含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯沙坦鉀組比較，&P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the losartan group,&P<0.05.

注：a: 正常組; b: 模型組; c: 氯沙坦鉀組; d: 黃連多糖高劑量組; e: 黃連多糖低劑量組。圖1 黃連多糖對各組大鼠腎組織病理的影響(× 200)Note. a: normal group; b: model group; c: losartan group; d: high-dose CCPW group; e: low-dose CCPW group.Figure 1 Effects of CCPW on renal histopathology in the rats of each experimental group

2.5 黃連多糖對各組大鼠血清IL-6、hs-CRP和TNF-α含量的影響

模型組大鼠血清IL-6、hs-CRP和TNF-α含量明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；氯沙坦鉀組及黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠血清IL-6、hs-CRP和TNF-α含量明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與氯沙坦鉀組比較，黃連多糖高劑量組、低劑量組大鼠血清IL-6、hs-CRP和TNF-α含量均呈不同程度的升高，其中黃連多糖低劑量大鼠血清hs-CRP 和TNF-α含量升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

糖尿病引起的腎損傷是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，危害巨大[8-9]。研究表明，在長期高血糖狀態(tài)下，多元醇等氧化活性產物、蛋白質糖基化、自氧化葡萄糖等水平均明顯升高，氧化應激與糖尿病引起的腎損傷密切相關[10-11]。SOD、CAT、GSH-Px和MDA是評價機體氧化應激水平的主要指標，SOD能清除O2-保護細胞免受氧化損傷，是生物體內清除自由基中最為重要的抗氧化酶[12]。CAT廣泛分布于各類組織中，可以迅速清除細胞的毒性代謝產物，從而對機體起到保護作用[13]。GSH-Px具有維持細胞結構和功能完整性的作用，其主要通過促進過氧化氫的分解、降低過氧化氫水平而實現(xiàn)[14]。MDA含量可以反應機體內脂質過氧化的程度，是評價脂質過氧化產物含量的指標。因此，降低氧化應激水平，將有助于減輕糖尿病引起的腎損傷；研究證實，當歸補血湯可以通過降低糖尿病大鼠的氧化應激水平，進而起到抗糖尿病腎病作用[15]。

表4 黃連多糖對各組大鼠血清IL-6、hs-CRP和TNF-α含量的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氯沙坦鉀組比較，&P<0.05。

Note. Compared with the normal group,*P<0.05. Compared with the model group,#P<0.05. Compared with the losartan group,&P<0.05.

除氧化應激外，炎癥反應在糖尿病引起的腎損傷過程中的作用也逐漸得到了人們的關注；研究表明，在糖尿病患者血清中，IL-6、hs-CRP和TNF-α等炎癥因子的含量均明顯升高[16]。IL-6可以通過體液免疫和細胞免疫功能介導宿主防御、組織損傷修復和炎癥反應等多種生物學過程，由活化單核細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞等合成，具有多種生物學效應；此外，IL-6也是聯(lián)系全身免疫反應和局部血管損傷的主要炎癥因子，在合成hs-CRP和急性期反應過程中也發(fā)揮重要作用[17]。在高血糖水平下，IL-6一方面可以引起T、B 細胞異常增殖和過度活化，從而促進腎系膜增殖；另一方面，IL-6也可以促進合成hs-CRP，hs-CRP含量增加可以促進單核細胞對內皮細胞的黏附作用，最終加劇其它炎癥介質的血管損傷作用[18]。TNF-α由巨噬細胞產生，是主要的炎癥因子，可通過自分泌效應作用于其它巨噬細胞，活化的巨噬細胞進而釋放多種促炎介質，最終使炎癥疾病持續(xù)進展[19]。因此，降低炎癥反應水平，有助于減輕糖尿病引起的腎損傷；研究證實，芪葵顆粒可以通過降低糖尿病大鼠的炎癥反應水平，進而起到抗糖尿病腎病作用[20]。

本研究以我國傳統(tǒng)中藥黃連中的有效成分黃連多糖為研究對象，探討其對糖尿病大鼠腎損傷是否具有保護作用。氯沙坦鉀為血管緊張肽Ⅱ受體拮抗劑，對長期高血糖引起的腎損傷具有較好的保護作用；同時，相關研究證實，氯沙坦鉀具有抗氧化及抗炎作用，因此選擇氯沙坦鉀作為陽性對照藥物[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的黃連多糖均對糖尿病大鼠的腎損傷均具有保護作用，且可以抑制氧化應激及炎癥反應。雖然黃連多糖高劑量組對模型大鼠腎損傷的保護作用、抑制氧化應激及炎癥反應能力均優(yōu)于低劑量組，但差異并無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，本研究的相關結果表明，黃連多糖具有減輕糖尿病大鼠腎損傷的作用，該作用與抑制氧化應激及炎癥反應有關，但具體的作用機制還有待于深入研究。