劉 穎，常志尚，徐宏偉，薛美蘭，李瑞英，梁 惠*

(青島大學(xué)1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071；2. 生物醫(yī)學(xué)公共支撐平臺(tái)，山東 青島 266021；3. 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 青島 266021)

糖尿病是一種以空腹血糖及糖化血紅蛋白異常升高為主要表現(xiàn)的慢性代謝性疾病。多項(xiàng)研究證實(shí)，腸黏膜屏障損傷與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。因此，修復(fù)腸黏膜損傷可望作為新的作用靶點(diǎn)用于糖尿病防治[3]，而針對(duì)腸黏膜屏障檢測方法的選擇，則成為降糖藥物改善腸黏膜屏障及其機(jī)制研究不可或缺的重要環(huán)節(jié)。目前，腸黏膜屏障檢測方法主要包括腸上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)觀察、緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測[4]及腸道屏障功能血清學(xué)指標(biāo)檢測[5]等，但其反映腸黏膜損傷及療效評(píng)價(jià)的靈敏性卻不盡相同。蜂膠是一種富含黃酮、萜烯等多種生物活性成分的天然產(chǎn)物[6]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究均表明，蜂膠具有降血糖作用[7]，但尚不清楚蜂膠的降糖作用是否與其對(duì)腸黏膜損傷的修復(fù)作用有關(guān)。本研究旨在以糖尿病大鼠為研究對(duì)象，對(duì)上述各種腸黏膜屏障功能檢測方法進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，為蜂膠降糖的腸黏膜損傷修復(fù)機(jī)制研究提供靈敏可靠的實(shí)驗(yàn)手段。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，160 ～ 180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK (京) 2016-0006]。大鼠飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK (魯) 2015 - 0003]，各組大鼠自由進(jìn)食和飲水，鼠房環(huán)境保持溫度(22 ± 2)℃，相對(duì)濕度50% ～ 60%，每小時(shí)換氣5次，12 h光照/黑暗交替。本實(shí)驗(yàn)獲得青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2014審字第09)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

蜂膠(每100 g中含總黃酮≥3.2 g)，由北京中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供；鏈脲佐菌素(STZ)及PVDF膜均購自北京 Solarbio科技有限公司；D-乳酸及連蛋白ELISA檢測試劑盒(美國Cloud-Clone Corp公司)；組織蛋白提取試劑盒購自美國Pierce Biotechnology公司；蛋白檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司；Claudin、occludin及ZO-1抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，其相應(yīng)二抗均購自美國Zymed Laboratories公司；β-actin抗體及其二抗、化學(xué)發(fā)光試劑盒，均購自美國Santa Cruz公司；高脂飼料(豬油10%，蔗糖20%，蛋黃粉15%，膽固醇1.2%，豬膽鹽0.2%，鼠維持飼料53.6%，均為國產(chǎn))。Accu-Chek Performa 羅氏卓越血糖儀、血糖檢測試紙，均購自上海羅氏檢測產(chǎn)品有限公司； TRANS-BLOT SD電轉(zhuǎn)膜儀及Variant II糖化血紅蛋白儀均購自美國Bio-Rad公司； DYY-60電泳儀(北京六一儀器廠)； JEM 1200型電子透射顯微鏡(日本JEOL)；RM 2135型石蠟切片機(jī)(德國LEICA)；ELx808型酶標(biāo)儀(美國BioTek)； GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立與分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，采用羅氏血糖儀檢測尾血血糖作為基礎(chǔ)血糖。依據(jù)基礎(chǔ)血糖值將大鼠隨機(jī)分為4組(n=12/組)，包括正常對(duì)照組、糖尿病模型組、80 mg/kg和160 mg/kg蜂膠干預(yù)組。模型組及各蜂膠干預(yù)組喂食高糖高脂飼料，正常對(duì)照組喂食普通飼料，持續(xù)3周。模型組及各蜂膠干預(yù)組腹腔注射1% STZ溶液40 mg/kg，正常對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)劑量檸檬酸緩沖液。1周后檢測尾血血糖，血糖值>11.1 mmol/L作為成模大鼠。蜂膠干預(yù)組分別以80 mg/kg及160 mg/kg 蜂膠灌胃成模大鼠，模型組及正常對(duì)照組灌以相應(yīng)劑量大豆油，各組繼續(xù)喂食相應(yīng)飼料，持續(xù)4周。大鼠組織取材于青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行[SYXK(魯)2015-0003]。禁食不禁水12 h后，檢測大鼠尾血血糖，30%烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈取血，同時(shí)留取回腸及結(jié)腸組織，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血糖(FBG)及糖化血紅和蛋白(HbA1c)水平檢測

采用羅氏卓越血糖儀檢測尾血血糖，采用高效液相色譜法檢測HbA1c含量，嚴(yán)格按照說明書操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測

采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測血漿D-乳酸(D-LA)及連蛋白(zonulin)含量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 回腸及結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)觀察

迅速留取大鼠回腸及結(jié)腸1 mm×2 mm組織塊，生理鹽水漂洗，2.5%戊二醛溶液固定24 h。PBS(pH=7.2)漂洗3次，1%鋨酸固定80 min，雙蒸水漂洗，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，50 nm～70 nm厚度切片，3% 醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別染色30 min及15 min，雙蒸水沖洗，透射電鏡觀察。每組觀察5張切片，每張切片觀察5個(gè)視野。

1.3.5 Western blot檢測回腸及結(jié)腸組織緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平

(1)蛋白質(zhì)樣品的制備、電泳和轉(zhuǎn)膜：稱取回腸及結(jié)腸組織，采用組織蛋白提取試劑制成1∶5(質(zhì)量濃度)的勻漿，12 000 r/min 4℃離心20 min提取上清液，采用蛋白檢測試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以20 μg蛋白/泳道上樣，采用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓80 V，進(jìn)入分離膠后將電壓提高到120 V，至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部即終止電泳。甲醇活化PVDF膜，按照從陰極到陽極依次為：濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序組裝轉(zhuǎn)印三明治，將其放入轉(zhuǎn)膜儀中，恒壓10 V，轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。

(2)樣品封閉、抗體孵育及圖像分析：將電轉(zhuǎn)完畢的PVDF膜標(biāo)記后，用含 5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉 1 h。洗膜后加入claudin、occludin及ZO-1抗體4℃孵育過夜。采用TBS緩沖液洗膜3次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，同時(shí)設(shè)β-actin為內(nèi)參照。再次采用TBS緩沖液洗膜3次，通過化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行曝光處理，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。對(duì)膠片進(jìn)行顯影、定影后，采用UVP GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)蛋白光密度值進(jìn)行檢測，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的光密度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠血糖水平的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠血糖及HbA1c含量明顯升高，分別達(dá)到正常對(duì)照組的5.92倍和2.59倍，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，具有顯著性差異(P<0.05)。補(bǔ)充80 mg/kg及160 mg/kg蜂膠后，大鼠血糖水平分別較模型組降低了35.9%和33.4%；HbA1c含量也分別降低了20.9%和27.3%，均具有顯著性差異(P<0.05)。但各干預(yù)組間比較，均未見顯著性差異 (P>0.05)。見表1。

2.2 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠腸黏膜屏障血清學(xué)檢測指標(biāo)的影響

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組血漿D-乳酸及連蛋白含量均有所升高，而80 mg/kg及160 mg/kg蜂膠補(bǔ)充使血漿D-乳酸及連蛋白含量均有不同程度降低，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間均未見顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.3 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠回腸及結(jié)腸組織上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)正常，無間隙增寬等異常表現(xiàn)。模型組大鼠與正常對(duì)照組比較，其回腸及結(jié)腸組織緊密連接、黏著連接、縫隙連接等細(xì)胞間連接裝置出現(xiàn)結(jié)構(gòu)松弛，電子密度降低及間隙增寬現(xiàn)象。蜂膠干預(yù)后，回腸及結(jié)腸組織上述細(xì)胞間連接裝置較模型組均發(fā)生不同程度改善，間隙變窄，與正常對(duì)照組接近。見圖1、圖2。

表1 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠血糖水平的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P< 0.05；與模型組比較，△P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the model group,△P< 0.05.

表2 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠腸黏膜屏障血清學(xué)檢測指標(biāo)的影響

注：a: 正常對(duì)照組; b:模型組; c: 80 mg/kg蜂膠干預(yù)組; d: 160 mg/kg 蜂膠干預(yù)組。TJ：緊密連接；AJ：黏著連接；DS：橋粒。圖2 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞連接裝置超微結(jié)構(gòu)的影響 (透射電鏡，× 50 000)Note. a: Control. b: Model. c: 80 mg/kg Propolis. d: 160 mg/kg propolis. TJ: Tight junctions.AJ: Adherens junctions.DS: Desmosomes.Figure 2 Effects of propolis on the ultrastructure of colonic mucosal epithelial cells in diabetic rats (transmission electron microscopy, × 50 000)

2.4 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠回腸組織緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，模型組回腸組織中claudin-1、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。80、160 mg/kg蜂膠干預(yù)組回腸組織中claudin-1、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均較模型組明顯升高，且具有劑量依賴性(P<0.05)。見圖3。

注：1: 正常對(duì)照組; 2:模型組; 3: 80 mg/kg蜂膠干預(yù)組; 4: 160 mg/kg 蜂膠干預(yù)組。*P<0.05 vs正常對(duì)照組;△P<0.05 vs 模型組;#P<0.05 vs 80 mg/kg 蜂膠干預(yù)組。圖3 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠回腸組織緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Note. 1: Control. 2: Model. 3: 80 mg/kg propolis. 4: 160 mg/kg propolis. *P<0.05 vs control.△P<0.05 vs model.#P<0.05 vs 80 mg/kg Propolis.Figure 3 Effects of propolis on the expression level of proteins related to the tight junction between ileum epithelial cells of diabetic rats

2.5 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠結(jié)腸組織緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸組織中claudin-1、occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。80 mg/kg蜂膠干預(yù)組結(jié)腸組織中claudin-1蛋白及160 mg/kg蜂膠干預(yù)組claudin-1、occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平均較模型組明顯升高，其中，ZO-1蛋白表達(dá)水平在兩干預(yù)組間存在劑量依賴性(P<0.05)。其余各組間比較，均無顯著性差異(P>0.05)。見圖4。

注：1: 正常對(duì)照組; 2:模型組; 3: 80 mg/kg蜂膠干預(yù)組; 4: 160 mg/kg 蜂膠干預(yù)組。*P<0.05 vs正常對(duì)照組;△P<0.05 vs 模型組;#P<0.05 vs 80 mg/kg 蜂膠干預(yù)組。圖4 蜂膠對(duì)糖尿病大鼠結(jié)腸組織緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Note. 1: Control; 2: Model; 3: 80 mg/kg Propolis; 4: 160 mg/kg Propolis. *P<0.05 vs Control;△P<0.05 vs Model;#P<0.05 vs 80 mg/kg Propolis.Figure 4 Effects of propolis on the expression level of proteins related to the tight junction between the colonic epithelial cells in diabetic rats

3 討論

本研究通過高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射的方法成功建立了糖尿病大鼠模型，并通過蜂膠補(bǔ)充，有效控制了糖尿病大鼠血糖及糖化血紅蛋白水平，表明蜂膠具有良好的降血糖效果，與相關(guān)報(bào)道一致[7-8]。隨后，本實(shí)驗(yàn)采用超微結(jié)構(gòu)觀察、Western blotting及血清學(xué)檢測三種實(shí)驗(yàn)方法，從不同角度對(duì)糖尿病大鼠腸黏膜屏障損傷狀況進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，以期獲得敏感可靠的腸黏膜屏障功能檢測方法，用于蜂膠降糖作用的腸黏膜屏障修復(fù)機(jī)制研究。

國內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，腸黏膜屏障完整性破壞在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。 Zhong等[1]對(duì)38例2型糖尿病患者和152例非糖尿病患者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者小腸絨毛性水腫的發(fā)生率高達(dá)78.9%，Lewis評(píng)分也顯著高于非糖尿病患者。Horton等[10]采用口服51Cr-EDTA的方法對(duì)20例2型糖尿病患者進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)其腸道滲透性均異常增高。Lee等[11]的研究則顯示，非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠在感染具有腸黏膜屏障破壞能力的野生型C.rodentium菌株后，不僅其腸黏膜屏障遭到破壞，同時(shí)，其胰島炎癥也呈現(xiàn)快速發(fā)展趨勢。以上人群研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，腸黏膜屏障損傷參與了糖尿病的發(fā)生發(fā)展并發(fā)揮關(guān)鍵作用，它也因此成為藥物降糖潛在的作用靶點(diǎn)。

本研究透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠回腸及結(jié)腸組織上皮細(xì)胞緊密連接及黏著連接發(fā)生間隙增寬、密度降低等不同程度異常改變，蜂膠補(bǔ)充有效改善了其緊密連接等細(xì)胞連接裝置損傷狀況，并具有一定劑量依賴性。緊密連接位于上皮細(xì)胞基底外側(cè)膜頂端，是腸黏膜上皮細(xì)胞間最主要的連接方式，與黏著連接、橋粒、縫隙連接等共同構(gòu)成細(xì)胞間連接裝置，在封閉細(xì)胞間隙，維持腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)與功能完整性方面發(fā)揮決定性作用[12]。本研究結(jié)果表明，腸黏膜細(xì)胞連接超微結(jié)構(gòu)觀察對(duì)于糖尿病大鼠腸黏膜屏障功能檢測具有較高的靈敏性，可用于降糖藥物的腸黏膜損傷修復(fù)療效觀察。

Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 糖尿病大鼠回腸和結(jié)腸組織中claudin-1、occludin及ZO-1等緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平均發(fā)生不同程度下調(diào)，補(bǔ)充蜂膠后，其下調(diào)狀況得到有效緩解和控制，且隨著蜂膠劑量的增加，改善效果尤為明顯。Claudin-1和occludin是緊密連接中最主要的跨膜蛋白，也是參與腸黏膜屏障功能調(diào)節(jié)的主要功能蛋白。它們?cè)诎馀c跨膜蛋白相互作用，在胞內(nèi)則通過支架蛋白ZO-1與肌動(dòng)蛋白等胞內(nèi)蛋白相互聯(lián)系。這種由多種跨膜蛋白及粘附分子組成的“拉鏈樣”結(jié)構(gòu)，環(huán)繞整個(gè)細(xì)胞呈帶狀分布，共同構(gòu)成細(xì)胞間穩(wěn)定的緊密連接體系[13]。多項(xiàng)研究指出，緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低可造成緊密連接崩解斷裂，導(dǎo)致腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)與功能損傷；上調(diào)腸黏膜緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，可使腸黏膜損傷得到修復(fù)，緩解疾病進(jìn)程[14-15]，本研究Western blotting與透射電鏡結(jié)果相互印證，得到了較為一致的結(jié)論，表明將緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測用于糖尿病大鼠腸黏膜損傷狀況評(píng)價(jià)亦具有較高的靈敏性，可作為藥物降糖的腸黏膜屏障修復(fù)機(jī)制研究較為可靠的實(shí)驗(yàn)手段之一。

D-乳酸是腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸道屏障遭到破壞時(shí)，D-乳酸可通過受損黏膜滲透入血，使循環(huán)血中D-乳酸含量升高；連蛋白是緊密連接通路重要蛋白，當(dāng)腸黏膜通透性升高時(shí)，連蛋白亦可釋放入血，引起血液中連蛋白水平增高，二者可在一定程度上反映腸道屏障損傷狀況[5]。而本研究血清學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿D-乳酸和連蛋白水平在各組大鼠間均無顯著性差別，與透射電鏡及Western blotting檢測結(jié)果存在不一致性。表明作為降糖藥物腸黏膜修復(fù)療效評(píng)價(jià)手段，腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)觀察及緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測的靈敏性可能更優(yōu)于腸道屏障功能血清學(xué)檢測。

此外，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)腸黏膜屏障功能檢測方法的比較分析并不全面，其他多種腸黏膜屏障功能檢測方法，如血漿內(nèi)毒素檢測、胃腸黏膜pH值測定、酚黃酞測定及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白含量檢測等尚未被涉及，將在以后的實(shí)驗(yàn)中加以完善和補(bǔ)充。

總之，腸黏膜屏障超微結(jié)構(gòu)觀察及緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測能較好反映糖尿病大鼠腸黏膜屏障損傷狀況，較血清學(xué)檢測具有更高的靈敏性，可成為降糖藥物腸黏膜屏障修復(fù)機(jī)制研究可靠的實(shí)驗(yàn)手段。同時(shí)，蜂膠降糖作用也與其調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，修復(fù)腸黏膜損傷有關(guān)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)得到青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所的大力支持，感謝實(shí)驗(yàn)室全體老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助。)