石 娜，張抒揚，牛海濤*

(1. 國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所)，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2. 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100010)

心血管疾病是世界上導致成年人死亡的主要疾病[1]，動脈粥樣硬化(動脈硬化)是引起心血管疾病的主要原因，動脈硬化是一種漸進性的慢性炎癥，通過固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)參與斑塊的產(chǎn)生、發(fā)展、穩(wěn)定和破裂[2]。動脈硬化由多種細胞亞型和細胞因子相互作用產(chǎn)生[3-4]，巨噬細胞在動脈硬化斑塊的病理生理學中起重要作用[5]。內皮下單核巨噬細胞使動脈硬化不斷發(fā)展，循環(huán)的單核細胞吸附在激活的動脈內皮細胞上，再遷移到內皮下，在生長因子的作用下分化成為巨噬細胞。巨噬細胞在脂質吸收、抗原呈遞、清除死細胞、細胞因子生成等動脈硬化的發(fā)展和消退過程中起重要作用[6]。位于斑塊內的巨噬細胞是動態(tài)平衡的，巨噬細胞的數(shù)量和炎癥狀態(tài)影響斑塊的發(fā)展[7]，而且有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的缺失能顯著減少小鼠動脈硬化的產(chǎn)生[8]。

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥和自身免疫性抗體[9]。RA由遺傳基因和環(huán)境因素共同作用所引起，研究表明，抗原蛋白或多肽的瓜氨酸化與RA發(fā)病有關，瓜氨酸化是RA特異性抗原被抗體識別的必要條件[10]，RA患者血清中存在抗瓜氨酸多肽抗體。環(huán)境因素和易感基因相互作用后，促進轉錄后調控的改變，引起自體蛋白瓜氨酸化。機體通過打破對含有瓜氨酸殘基自體蛋白的免疫耐受，激活自身免疫反應。隨后，炎癥反應轉移到關節(jié)部位，引起滑膜炎和關節(jié)結構的損傷。這一過程涉及的免疫反應有：固有免疫、適應性免疫、炎癥及組織應答，但機理仍不明確[11]。

注射K/BxN血清引起的關節(jié)炎動物模型對RA研究有十分重要的意義，白細胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)和集落刺激因子(GM-CSF)都在發(fā)病中起重要的作用[12]，巨噬細胞和中性粒細胞在促進關節(jié)炎的發(fā)展中起關鍵作用，RA患者炎性滑液中巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量增加[13]。K/BxN血清來源于抗6-磷酸葡萄糖異構酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)抗體呈陽性的K/BxN小鼠，K/BxN小鼠由KRN雄鼠和NOD/LtJ雌鼠雜交所得，其血液中含有致病性自身抗體GPI，抗GPI抗體與GPI抗原結合形成免疫復合物，從而激活中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞等固有免疫細胞。單純的免疫復合物并不致病，但是如果軟骨表面表達GPI抗原，抗GPI抗體與之結合形成免疫復合物[13]，進而產(chǎn)生較嚴重的炎癥性關節(jié)炎。

由于RA患者常合并發(fā)生動脈硬化，且引起心血管疾病的傳統(tǒng)危險因素如吸煙、高血壓、高脂飲食等與RA的炎癥標志物相互作用，在心血管疾病的發(fā)病中均起重要的作用[14]。很多研究表明，T細胞、B細胞和巨噬細胞等在動脈硬化和RA的發(fā)病中均起非常重要的作用[11, 15-17]。因此，我們通過給ApoE-/-小鼠飼喂高脂食物誘發(fā)動脈硬化癥狀，再注射K/BxN血清誘發(fā)關節(jié)炎癥狀，模擬動脈硬化合并關節(jié)炎的疾病狀態(tài)，通過比較血脂水平的變化及動脈硬化斑塊的差異，以及產(chǎn)生動脈硬化后對關節(jié)腫脹程度的影響，流式細胞術檢測其免疫細胞的分布情況，從而對動脈硬化合并關節(jié)炎的發(fā)病機理提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級ApoE-/-雌鼠16只，體重為23 ～ 25 g，8周齡，由北京維通利華實驗動物有限公司提供[SCXK (京) 2016-0006]。K/BxN小鼠由本實驗室通過KRN雄鼠(由哈佛大學贈送)和NOD/LtJ雌鼠(由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK (京) 2014-0004])交配繁殖，用來提供抗GPI抗體呈陽性的小鼠血清。所有小鼠均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房[SYXK (京) 2015-0035]，動物實驗方案已得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)的審批[ILAS-PG-2015-002]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

徠卡冰凍切片包埋劑(OCT)購自德國徠卡公司，血脂檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Mouse Magnetic 6 plexAssay (LXSAMSM-06)購自R&D公司，CD3、CD4、CD11b流式抗體均購自BD Bioscience公司，高脂飼料購自北京博泰宏達生物技術有限公司，高脂飼料配方如下：15.8%脂肪，1.25%膽固醇和0.5%膽酸鹽；流式細胞儀購自美國BD公司，冰凍切片機購自德國徠卡公司，酶標儀購自美國Thermo公司，Luminex 200購自美國R&D公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及關節(jié)炎評分

觀察注射K/BxN血清前高脂食物對ApoE-/-小鼠的影響，將ApoE-/-雌鼠隨機分為高脂食物組(HFD)和普通食物組(CD)，每組6～8只，分別飼喂高脂食物和普通食物。觀察注射K/BxN血清后高脂食物和K/BxN血清對ApoE-/-小鼠的影響，分別給17周齡HFD和CD組小鼠腹腔注射抗GPI抗體呈陽性的K/BxN血清(通過頜下靜脈采血法對K/BxN小鼠采血，待血液凝固后4000 r/min離心 10 min，提取上清獲得血清，ELISA法檢測血清抗GPI抗體水平，方法同1.3.4，將同一時間段抗GPI抗體呈陽性的K/BxN血清混勻，即可進行腹腔注射)，0.2 mL/次/周，同時每周用游標卡尺測量小鼠后肢踝關節(jié)寬度并記錄四肢關節(jié)炎評分(clinical score)(總數(shù)=12)，0=正常，1=腕部腫脹，2=腫脹至足背部，3=腫脹至腳趾。

1.3.2 脾臟和骨髓CD3、CD19和CD11b細胞檢測

小鼠注射戊巴比妥鈉麻醉后處死，取脾臟稱重后，用載玻片進行研磨，取研磨下層的細胞液，用紅細胞裂解液進行裂解5 min，2340 r/min離心5 min，計數(shù)，取大約1×106個細胞，2340 r/min離心5 min，加入抗體工作液，4℃避光孵育30 min，2340 r/min離心5 min，棄上清液，洗1～2次，上流式細胞儀(AriaⅠ，Becton Dixon，USA)檢測。取完脾臟后將后肢剪下，用1 mL注射器將骨髓抽取到含5%胎牛血清的PBS中，用注射器反復吹打混勻，直到骨髓細胞散在溶解于含5%胎牛血清的PBS中，流式抗體染色后同上述步驟上流式細胞儀(AriaⅠ，Becton Dixon，USA)檢測，數(shù)據(jù)分析用 Flow Jo ver. 10(USA)。

1.3.3 動脈硬化癥狀檢測

油紅O染色觀察主動脈瓣根部變化，取主動脈瓣根部用OCT包埋，用冰凍切片機修平組織，溫度-20℃，切片厚度7 μm，置于玻片上，油紅O染色后在光鏡下觀察脂肪浸潤情況，用Image-pro Plus 6軟件評估每張切片染色區(qū)域占總橫截面的百分比。

1.3.4 血清學檢測

血脂水平檢測，血清總膽固醇(TCHO)濃度、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度和甘油三酯(TG)濃度通過ELISA法檢測，按照試劑盒說明書操作。細胞因子檢測，Luminex 200檢測血清TNF-α、IL-6、IL-23P19、IL-17A、IL-10、IFN-γ水平，按照Mouse Magnetic 6 plex Assay(LXSAMSM-06)說明書操作。血清抗GPI抗體水平檢測，將6-磷酸葡萄糖異構酶用PBS稀釋到5 μg/mL 4℃過夜包被于96孔板，PBST洗板一次后，1% BSA封閉抗原，再用血清稀釋液將待測血清稀釋至1∶100(一抗)加入待測孔，同時設置陽性孔和空白孔，37℃孵育1 h后，結合1∶2000稀釋的堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG(二抗)，室溫孵育1 h，PBST洗板后用磷酸酶底物顯色，當肉眼可見陽性孔顯黃色時，用酶標儀檢測405 nm波長時的吸光度(OD)值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 26周齡ApoE-/-小鼠表現(xiàn)出動脈硬化合并關節(jié)炎癥狀

飼喂高脂食物并注射K/BxN血清后，實驗組小鼠100%產(chǎn)生動脈硬化和關節(jié)炎癥狀。飼喂高脂食物后ApoE-/-小鼠出現(xiàn)體重增加、皮下脂肪增厚、背毛凌亂、行動遲緩。剖檢可見脾臟、心臟及主動脈周圍被脂肪包裹，腹腔內充滿脂肪。注射K/BxN血清1周后肉眼可見小鼠踝關節(jié)、腳趾和腳掌腫脹、顏色發(fā)紅，通過游標卡尺量取踝關節(jié)寬度發(fā)現(xiàn)比注射K/BxN血清前明顯增加。

2.2 高脂食物和K/BxN血清處理對ApoE-/-小鼠免疫細胞的影響

2.2.1 高脂食物和K/BxN血清使ApoE-/-小鼠脾臟CD3+T細胞和CD19+B細胞下調，CD11b+巨噬細胞上調

脾是體內最大的外周淋巴器官，B細胞與T細胞分隔定位于不同區(qū)域，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。我們分析ApoE-/-小鼠分別飼喂高脂和普通食物后再注射K/BxN血清，CD3、CD19、CD11b在脾細胞中的分布情況。與ApoE-/-小鼠飼喂普通食物后再注射K/BxN血清相比，飼喂高脂食物后再注射K/BxN血清的ApoE-/-小鼠脾臟CD3+T細胞占淋巴細胞的百分比例下降(P=0.0043<0.01)(見圖1A和1B)，CD19+B細胞占淋巴細胞的百分比例下降(P=0.0007<0.001)(見圖1C和1D)，CD11b+巨噬細胞占淋巴細胞的百分比例上升(P=0.02<0.05)(見圖1E和1F)。

2.2.2 高脂食物和K/BxN血清使ApoE-/-小鼠骨髓CD3+T細胞和CD19+B細胞下調，CD11b+巨噬細胞上調

骨髓是機體重要的中樞淋巴器官，多能造血干細胞在骨髓中增殖，進而分化、發(fā)育、成熟為粒細胞和B細胞等。通過比較ApoE-/-小鼠高脂食物和普通食物處理后再注射K/BxN血清，我們發(fā)現(xiàn)與普通食物和K/BxN血清處理相比，高脂食物和K/BxN血清處理后，骨髓CD3+T細胞占淋巴細胞的百分比例下降(P=0.0007<0.001)(見圖2A和2B)，CD19+B細胞占淋巴細胞的百分比例下降(P=0.0007<0.001)(見圖2C和2D)，CD11b+巨噬細胞占淋巴細胞的百分比例上升(P=0.0013<0.01)(見圖2E和2F)。

2.3 注射K/BxN血清前與注射后，高脂食物均使ApoE-/-小鼠動脈硬化癥狀加重

2.3.1 注射K/BxN血清前與注射后，高脂食物使ApoE-/-小鼠血脂水平升高

如圖3A、3C和3E顯示，ApoE-/-小鼠注射K/BxN血清前，高脂食物組比普通食物組血清LDL-C濃度(P=0.0007<0.001)、TCHO濃度(P=0.0007<0.001)和TG濃度(P=0.0007<0.001)顯著升高；如圖3B、3D和3F顯示，ApoE-/-小鼠注射K/BxN血清后，與普通食物與K/BxN血清處理組相比，高脂食物與K/BxN血清共同處理使血清LDL-C濃度(P=0.0012<0.001)、TCHO濃度(P=0.0007<0.001)和TG濃度(P=0.0007<0.001)顯著升高。提示注射K/BxN血清前與注射后，高脂食物均使ApoE-/-小鼠血脂水平(LDL-C濃度、TCHO濃度和TG濃度)顯著升高。

注：HFD：高脂食物；CD：普通食物；K/BxN serum：K/BxN血清；ApoE-/-：ApoE基因敲除，●代表ApoE基因敲除小鼠經(jīng)過高脂食物和K/BxN血清處理，▲代表ApoE基因敲除小鼠經(jīng)過普通食物和K/BxN血清處理，下圖同；A、C、E：流式細胞術檢測高脂食物組和普通食物組小鼠脾臟CD3、CD19、CD11b細胞直方圖，B、D、F：高脂食物組和普通食物組脾臟CD3+、CD19+、CD11b+細胞占淋巴細胞的百分比(%)。高脂食物組與普通食物組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖1 高脂食物與K/BxN血清處理使ApoE-/-小鼠脾臟CD3+T細胞和CD19+B細胞下調，CD11b+巨噬細胞上調Note. HFD: high fat diet; CD: control diet. K/BxN serum: K/BxN serum. ApoE-/-: ApoE gene knockout, ● It represents that ApoE gene knockout mice were fed with high fat diet and intra-peritoneally injected with K/BxN serum. ▲ It represents that ApoE gene knockout mice were fed with the control diet and intra-peritoneally injected with K/BxN serum. The same with the following figures.A,C,E: The histogram of CD3, CD19 and CD11b cells of splenocytes in the HFD and the CD groups by flow cytometry, B, D, F: the splenic CD3+, CD19+ and CD11b+cells account for total lymphocytes of mice in the HFD and CD groups (%).The HFD group compared with the CD group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Figure 1 CD3+T cells and CD19+B cells were downregulated, CD11b+macrophages were upregulated in the splenocytes of ApoE-/-mice after treatment of HFD and K/BxN serum

注：A、C、E：流式細胞術檢測高脂食物組和普通食物組小鼠骨髓CD3、CD19、CD11b細胞直方圖，B、D、F：高脂食物組和普通食物組骨髓CD3+、CD19+、CD11b+細胞占淋巴細胞的百分比(%)。高脂食物組與普通食物組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖2 高脂食物與K/BxN血清處理使ApoE-/-小鼠骨髓CD3+T細胞和CD19+B細胞下調，CD11b+巨噬細胞上調Note. A,C,E: The histogram of CD3, CD19 and CD11b cells of bone marrow in the HFD and the CD groups by flow cytometry. B, D, F: the bone marrow CD3+, CD19+ and CD11b+cells account for total lymphocytes of mice in the HFD and CD groups (%).The HFD group compared with the CD group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Figure 2 CD3+T cells and CD19+B cells were downregulated, CD11b+macrophages were upregulated in the bone marrow of ApoE-/-mice after treatment of HFD and K/BxN serum

注：A：注射K/BxN血清前血清LDL-C濃度；B：注射K/BxN血清后血清LDL-C濃度；C：注射K/BxN血清前血清TCHO濃度；D：注射K/BxN血清后血清TCHO濃度；E：注射K/BxN血清前血清TG濃度；F：注射K/BxN血清后血清TG濃度。高脂食物組與普通食物組比較，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。圖3 注射K/BxN血清前與注射后ApoE-/-小鼠血清LDL-C濃度、TCHO濃度和TG濃度Note. A: The level of serum LDL-C of ApoE-/- mice before K/BxN serum injection. B: The level of serum LDL-C of ApoE-/- mice after K/BxN serum injection. C: The level of serum TCHO of ApoE-/- mice before K/BxN serum injection. D: The level of serum TCHO of ApoE-/- mice after K/BxN serum injection. E: The level of serum TG of ApoE-/- mice before K/BxN serum injected. F: The level of serum TG of ApoE-/- mice after K/BxN serum injected. The HFD group compared with the CD group, * P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001.Figure 3 The levels of serum LDL-C, TCHO and TG of ApoE-/- mice before and after K/BxN serum injection

2.3.2 高脂食物使ApoE-/-小鼠主動脈瓣根部斑塊面積增加

如圖4A顯示，ApoE-/-小鼠飼喂高脂食物和普通食物后注射K/BxN血清都能使主動脈瓣根部產(chǎn)生斑塊。如圖4B顯示，與普通食物與注射K/BxN血清處理組相比，高脂食物與注射K/BxN血清處理組的斑塊面積占橫截面積的比更高(P=0.05)。

注：A：高脂食物組(HFD)和普通食物組(CD)ApoE-/-小鼠主動脈瓣根部冰凍切片油紅O染色圖(× 40)；B：高脂食物組和普通食物組ApoE-/-小鼠主動脈瓣根部冰凍切片油紅O染色陽性區(qū)域占主動脈瓣根部橫截面積百分比(%)； 代表ApoE基因敲除小鼠經(jīng)過高脂食物和K/BxN血清處理，代表ApoE基因敲除小鼠經(jīng)過普通食物和K/BxN血清處理。高脂食物組與普通食物組比較，*P < 0.05。圖4 主動脈瓣根部斑塊油紅O染色Note. A: Aortic root of ApoE-/- mice in HFD and CD groups (× 40). B: Oil red O positive area account for cross section of aortic root (%). It represents that ApoE gene knockout mice were fed with high fat diet and intra-peritoneally injected with K/BxN serum. It represents that ApoE gene knockout mice were fed with the control diet and intra-peritoneally injected with K/BxN serum. The HFD group compared with the CD group, *P < 0.05.Figure 4 Histological changes of the atheroslerotic plaque at the aortic valve root. Oil red O staining

2.4 注射K/BxN血清前后，高脂食物組ApoE-/-小鼠的踝關節(jié)腫脹程度產(chǎn)生變化

如圖5A和5B顯示，注射K/BxN血清后比注射前所有ApoE-/-小鼠踝關節(jié)均產(chǎn)生了腫脹，飼喂高脂食物的ApoE-/-小鼠踝關節(jié)寬度和關節(jié)炎評分的升高值顯著低于飼喂普通食物組。

注：A：注射K/BxN血清后比注射前各組ApoE-/-小鼠踝關節(jié)寬度的升高值；B：注射K/BxN血清后比注射前各組ApoE-/-小鼠關節(jié)炎臨床評分的升高值(0 ～ 12)。高脂食物組與普通食物組比較，*P < 0.05。圖5 注射K/BxN血清前后各組ApoE-/-小鼠踝關節(jié)寬度和關節(jié)炎臨床評分(0 ～ 12)的升高值Note. A: The increased ankle width of all ApoE-/- mice between two groups. B: The increased clinical scores (0 - 12) of all ApoE-/- mice between two groups. The HFD group compared with the CD group, *P < 0.05.Figure 5 The increased ankle width and clinical scores (0 - 12) of all ApoE-/- mice before and after K/BxN serum injection between two groups

2.5 細胞因子檢測結果

此外，細胞因子檢測結果顯示，各組之間無顯著性差異(結果未呈現(xiàn))。

3 討論

載脂蛋白E(ApoE)具有抗動脈硬化的功能[18-19]，研究表明此功能與載脂蛋白E能清除血漿中多余的脂蛋白有關，血漿中脂蛋白沉積過多可引起斑塊產(chǎn)生；載脂蛋白E還可以對血管壁、免疫系統(tǒng)和骨髓發(fā)揮作用[20]。載脂蛋白E可抑制平滑肌細胞增殖[21-22]、高脂血癥小鼠NF-κB介導的炎癥以及動脈硬化[23]，從而控制心血管系統(tǒng)的炎癥。ApoE基因敲除小鼠表現(xiàn)出人類ApoE基因缺陷的特征，并且通過飼喂高脂、高膽固醇飲食后誘發(fā)動脈硬化[18]。本研究中通過高脂食物喂養(yǎng)使ApoE-/-小鼠血脂水平升高(包括血清LDL-C濃度、TCHO濃度和TG濃度升高)及動脈硬化斑塊增加，提示飼喂高脂食物可以誘發(fā)ApoE-/-小鼠產(chǎn)生顯著的動脈硬化癥狀。注射K/BxN血清后，飼喂高脂食物的ApoE-/-小鼠關節(jié)炎癥狀比飼喂普通食物的ApoE-/-小鼠輕微，但是動脈硬化癥狀更嚴重。同時我們發(fā)現(xiàn)，注射K/BxN血清后高脂食物組和普通食物組ApoE-/-小鼠血清LDL-C濃度、TCHO濃度和TG濃度均低于注射血清前，推測其原因可能是由于高脂食物喂養(yǎng)時間太長，或者注射K/BxN血清能夠減弱動脈硬化癥狀，我們計劃通過進一步實驗來驗證以上推測。

很多研究證實在RA的發(fā)病機制中，T、B淋巴細胞和巨噬細胞都起到非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)呈陽性的RA患者滑液組織中T、B淋巴細胞含量均升高[11, 15]，其中75%～90%的淋巴細胞是T細胞。T細胞與包括B細胞在內的抗原呈遞細胞(APCs)相互作用，APC分泌細胞因子的能力影響Th1/Th2值，通過調控Th1/Th2值使之趨于平衡，從而降低炎癥水平，因此，RA與激活的Th1細胞有關，Th17亞型在RA發(fā)病中也起重要作用[24]。成熟的B淋巴細胞表面表達Ⅱ型主要組織相容性復合物(MHC-Ⅱ)，可作為抗原遞呈細胞(APC)在抗體產(chǎn)生中起重要作用。次級淋巴組織中的B細胞分泌自身免疫性抗體、抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)和類風濕因子(RF)[11]，這些抗體反應疾病的發(fā)展和預后[25]，同時臨床研究發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗(Rituximab)可以降低B細胞和RA的疾病活動度并減輕關節(jié)損傷[26-27]。因此，B淋巴細胞通過作用于APC、產(chǎn)生自身抗體等，并且活化T淋巴細胞，促進T淋巴細胞浸潤于滑膜組織。

T、B淋巴細胞和巨噬細胞對動脈硬化有調控作用[16-17]。在動脈硬化斑塊中，T細胞占免疫細胞的比例是可變的，在引發(fā)炎癥反應方面起重要的作用，Th1細胞有促動脈硬化的作用，Th2細胞的作用還存在爭議，調節(jié)T細胞(Tregs)通過釋放轉換生長因子β和IL-10抑制動脈硬化的發(fā)生[16]。B細胞在動脈硬化中的作用機理較復雜：分泌促炎細胞因子、提呈抗原給T細胞、以及分化為漿細胞產(chǎn)生免疫球蛋白。其中B1a細胞和B1b細胞保護機體不產(chǎn)生動脈硬化，而B2細胞促進動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展[28]。

巨噬細胞和單核細胞在炎癥相關疾病中起重要作用，包括動脈硬化、關節(jié)炎、心肌梗塞等[29]。巨噬細胞的累積是慢性炎癥發(fā)展中很重要的一步[30]，單核細胞被環(huán)境因素刺激后，遷移并浸潤到內皮細胞中，引起動脈硬化斑塊中巨噬細胞升高[29]。CD11b又叫整合素αM，在巨噬細胞表面表達，是異質二聚體整合素αMβ2(巨噬細胞-1抗原)的組成部分[31]。研究表明，CD11b+細胞在鼻病毒誘導的炎癥反應中起重要作用[31]。

我們的研究中高脂食物與K/BxN血清處理后使ApoE-/-小鼠骨髓和脾臟的CD19+B細胞下調，我們推測是由于B細胞下調，導致漿細胞下調，從而引起B(yǎng)細胞分泌的抗GPI抗體下調，最終引起ApoE-/-小鼠踝關節(jié)腫脹程度和關節(jié)炎評分下降，以此推測需要進一步的工作來進行驗證。B細胞下調引起活化的T細胞下調。高脂食物使骨髓和脾臟CD11b+巨噬細胞上調，且動脈硬化癥狀加重，由于巨噬細胞的累積引發(fā)慢性炎癥反應，從而加重動脈硬化癥狀，包括血脂水平的升高以及動脈硬化斑塊的顯著增加。有研究表明高脂血癥使小鼠Hdc+CD11b+髓樣細胞增加，從而促進動脈硬化中的肥大細胞形成[27]。肥大細胞是炎性細胞，其數(shù)量隨病變加重而升高[33]。

綜上所述，高脂食物和K/BxN血清可以誘發(fā)ApoE-/-小鼠動脈硬化和關節(jié)炎，通過流式細胞術分析顯示高脂食物和K/BxN血清使ApoE-/-小鼠骨髓和脾臟的CD19+B細胞下調，可能引起血清抗GPI抗體下調，引起踝關節(jié)腫脹程度和關節(jié)炎評分下降，同時引起骨髓和脾臟的CD3+T細胞下調，骨髓和脾臟CD11b+巨噬細胞上調，引起動脈硬化癥狀加重。這一結論有助于我們對動脈硬化合并關節(jié)炎小鼠免疫細胞的分布有更全面、深刻的認識，并為臨床研究提供一定的實驗依據(jù)。