仰明明，牛 婷，劉 擎，張瀟涵，蔣靈筆 ，李豪斌，王麗京，李江超*

(1. 廣東藥科大學基礎學院血管生物學研究所，廣州 510006；2. 廣東省中醫(yī)院珠海分院病理科，廣東珠海 519015)

MMP12(matrix metalloproteinase-12)，于1975年首次在小鼠腹腔的巨噬細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)[1]，是MMPs家族的重要成員，是一種廣泛底物酶。MMP12也稱為巨噬細胞彈性蛋白酶(macrophage elastase)，是主要通過巨噬細胞、單核細胞等炎性細胞主動分泌的一種內(nèi)切蛋白酶，幾乎能分解全部細胞外基質(zhì)成分和血管成分，尤其對富含彈性纖維的血管、肺等組織作用明顯，并且是單核細胞募集所必需的[2 - 3]。最早關于MMP12基因敲除小鼠的報道發(fā)現(xiàn)巨噬細胞MMP12敲除后降解細胞外基質(zhì)的能力明顯減弱[4]。這種基因工程小鼠可用于免疫學、自身免疫研究、炎癥和代謝組學研究及酶缺乏癥等表型研究。同時來自MMP12-/-小鼠的巨噬細胞或骨髓細胞顯示異常生理功能[3, 5 - 6]。

巨噬細胞(macrophage)屬于單個核吞噬系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system)中的一類細胞，由于其功能的異質(zhì)性，在器官發(fā)育、清除病原體、介導炎癥反應、組織重塑和修復中均發(fā)揮著重要作用[7]。不同組織的微環(huán)境對其增殖、分化、激活和極化產(chǎn)生不同影響，使其呈現(xiàn)出不同表型，發(fā)揮不同生物學功能[8]。巨噬細胞一般可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和旁路活化的M2型巨噬細胞[9]。M1型巨噬細胞能夠幫助宿主抵御病毒和微生物的感染，抑制腫瘤，產(chǎn)生多種炎癥因子，從而激活免疫反應；M2型巨噬細胞能夠促進細胞碎片的清除、血管生成、基質(zhì)重塑，損傷組織的修復[10]，在腫瘤組織中利于腫瘤的生長[11]。

傳統(tǒng)觀點認為巨噬細胞由成體骨髓單核細胞分化而來的，即骨髓中的造血干細胞分化為單核細胞，巨噬細胞再從單核細胞分化而來。此外，巨噬細胞還可能來源于卵黃囊和胎肝單核細胞[12]，且這些來源的巨噬細胞在出生前已存在組織中，然而不同組織中巨噬細胞確切的來源目前尚不明確[13]。

目前，已知MMP12主要是由巨噬細胞主動分泌的一種內(nèi)切蛋白酶，但小鼠缺失MMP12后，血液以及白色脂肪中巨噬細胞的具體影響尚不明確。最近一些文獻報告顯示：在吸煙患者中，巨噬細胞彈性蛋白酶(MMP12)能夠抑制白色脂肪組織擴張[14]。并且Heinecke等人發(fā)現(xiàn)，MMP12缺失在一定條件下能改變巨噬細胞的浸潤與極化。如：在高脂喂養(yǎng)的小鼠中敲除MMP12有助于巨噬細胞向M2型分化[15]。

本研究對MMP12基因缺失小鼠的血常規(guī)及巨噬細胞進行了初步分析，發(fā)現(xiàn)MMP12能影響血液細胞的發(fā)育或分化：與MMP12+/+小鼠相比，MMP12-/-小鼠血液中的巨噬細胞顯著下降，但脂肪組織中CD68表達明顯增加。結果初步表明MMP12可以改變外周血以及白色脂肪中的巨噬細胞。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

B6.129X-Mmp12tm1Sds/J基因小鼠，背景是C57BL/6 J小鼠，編號：004855，購自美國Jackson實驗室；C57BL/6 J小鼠購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心[SCXK (粵) 2013 - 0002]。實驗動物均在SPF級的環(huán)境中飼養(yǎng)[SYXK (粵) 2017-0125]，飼養(yǎng)相對溫度維持22℃ ～ 28℃，相對濕度維持40% ～ 60%，每天晝夜明暗交替為12 h/12 h，并每天晚上8:00 ～ 10:00為紫外燈照射殺菌時間。本研究中小鼠相關實驗獲得廣東藥科大學動物倫理委員會的批準許可，動物福利倫理批準號為：gdpulac2017006，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

PCR 引物購自上海生工生物有限公司；流式細胞術檢測抗體：CD45-precp5.5(B218549)、CD11b-FITC(B22-4362)、F4/80-Bv421(B242663)，購自Biolegend公司；免疫組化檢測抗體CD68(BA3638), 購自BOSTER公司；DAB顯色試劑盒，貨號：8059S，購自Cell Signaling Technology公司；紅細胞裂解液，貨號：GAS-010，購于Life Technologies公司；瓊脂糖粉購于西班牙Biowest公司；牛血清白蛋白(BSA)購自上海生工。

蘇木素和伊紅購于北京世濟合力生物科技有限公司；中性樹膠，購于廣州市秀威貿(mào)易有限公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉購于天津大茂化學試劑廠；無水乙醇、甲醇、二甲苯、氯化鈉、氯化鉀、30%過氧化氫等購于廣州化學試劑廠；包埋盒、載玻片、蓋玻片均購于江蘇世泰實驗器材有限公司；EDTA·K2抗凝管采集血樣，進行血常規(guī)，流式采血使用ACD抗凝(Sigma)。

獨立送回風凈化籠具(蘇杭實驗動物設備廠)；PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，PCR Mix購自美國Thermo Fisher公司；利用全自動五分類血液分析儀進行檢測分析，其型號XT-2000i,SYSMEX日本；檢測時，設置小鼠血樣程序進行檢測。流式細胞儀型號為：BD FACSCantoTMⅡ。

1.3 實驗方法

1.3.1 MMP12基因的鑒定PCR方法

MMP12小鼠基因鑒定：野生型條帶：引物1∶5′-GCTAGAAGCAACTGGGCAAC-3′，引物3∶5′-ACAT CCTCACGCTTCATGTC-3′，擴增條帶為1064 bp。MMP12-/-突變條帶: 引物3∶5′-CACGAGACTAGT GAGACGTG-3′，引物4∶5′-ACATCCTCACGCTTC ATGTC-3′，擴增條帶為1400 bp。PCR反應條件:94℃預變性3 min，94℃ 30 s、58℃ 50 s、72℃ 1 min；循環(huán)38次；72℃延伸10 min，4℃冷卻擴增產(chǎn)物。引物3和引物4是鑒定突變型條帶，擴增條帶為1400 bp，引物1和引物2是鑒定野生型條帶，擴增條帶為1064 bp。在配置好的1.2%瓊脂糖凝膠中，利用TAE電泳緩沖液進行電泳.設定條件：150 V，20 min。再將凝膠放置在凝膠成像系統(tǒng)里，電腦成像系統(tǒng)里觀察PCR的電泳結果[16]。

1.3.2 MMP12-/-小鼠血常規(guī)檢測

取24周齡的MMP12-/-雄性小鼠和MMP12+/+雄性小鼠(體重30 ～ 35 g)各6只。麻醉約1 min，眼眶取血200 μL到1 mL的EDTA·K2抗凝管中待測，使用XT-2000i血細胞分析儀(Sysmex)進行血細胞的分類計數(shù)分析，在廣東動物監(jiān)測所進行檢測。注意上機前4℃放置。

1.3.3 病理學研究

小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠的白色脂肪。10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，鏡檢。免疫組化：一抗為兔多克隆抗體CD68(Boster,BA3638),1∶100,4℃過夜孵育;二抗為過氧化辣根酶標記山羊抗兔IgG,1∶100,37℃1 h,DAB顯色2 min,蘇木精復染20 s。

1.3.4 流式細胞術檢測

小鼠麻醉后眼眶取血，收集新鮮血液置抗凝管中。從血液樣本中，各取100 μL血漿原液加入標記好的流式管中，然后分別加入流式熒光抗體CD45-precp5.5、CD11b-FITC、F4/80-Bv421震蕩混勻，室溫下，避光孵育30 min。最后加入1 mL 1%預冷的多聚甲醛液固定混勻,2～8℃避光保存。在24 h之內(nèi)進行全血法流式細胞術檢測分析，在進行分析前，以白細胞中的單核細胞進行巨噬細胞的設區(qū)域設門，檢測標本陽性率和熒光強度[17]。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MMP12-/-小鼠的鑒定

將MMP12+/-雄鼠和MMP12+/-雌鼠雜交，獲得的子代有三種情況MMP12+/+、MMP12+/-和MMP12-/-，經(jīng)鑒定后得到實驗鼠突變型小鼠MMP12-/-有一條條帶,為1400 bp；野生型小鼠MMP12+/+為1064 bp一條條帶；兩條條帶都有的為雜合子小鼠MMP12+/-，結果如圖1。

注:M:DNA marker2000;陽性MMP12-/-小鼠為1#、2#、3#、5#，雜合子MMP12+/-小鼠為4#。圖1 MMP12基因PCR鑒定圖Note. M: DNA marker2000; positive mice MMP12-/- are 1#, 2#, 3#, 5# mice, and heterozygous MMP12+/- mice are 4#.Figure 1 PCR identification of MMP12 gene

2.2 MMP12-/-小鼠的血常規(guī)檢測

注：A：白細胞總數(shù)計數(shù)；B：紅細胞計數(shù)；C：血紅蛋白量；D：血小板計數(shù)；E：單核細胞數(shù)(上)，百分數(shù)(下)；F：淋巴細胞數(shù)(上)，百分數(shù)(下)；G：中性粒細胞數(shù)(上)，百分數(shù)(下)；H：嗜酸性粒細胞數(shù)(上)，百分數(shù)(下)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。圖2 血常規(guī)中的各項指標Note. A： White blood cell count. B： Red blood cell count. C： Hemoglobin amount. D： Platelet count. E： Monocyte count (top) and percentage (bottom). F： Lymphocyte number (top) and percentage (bottom). G： Neutrophil number (top) and percentage (bottom). H： Eosinophil count (top) and percentage (bottom). *P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.Figure 2 Routine blood examination indicators

血常規(guī)檢測結果顯示，白細胞計數(shù)、中性粒細胞數(shù)以及百分數(shù)無顯著差異(圖2A以及2G)。但MMP12-/-小鼠的紅細胞計數(shù)、血紅蛋白量、血小板計數(shù)、單核細胞數(shù)以及其百分數(shù)與MMP12+/+小鼠相比，均有下降趨勢且具有顯著性差異(*P<0.05，**P<0.01，圖2B、2C、2D以及2E)。淋巴細胞數(shù)和嗜酸性細胞數(shù)變化不大。但其百分數(shù)與MMP12+/+小鼠相比，顯著性上升(*P<0.05，**P<0.01，圖2F與2H)。

2.3 MMP12-/-小鼠外周血中的巨噬細胞下調(diào)

由上述血常規(guī)檢測結果可知，與同周齡的MMP12+/+小鼠相比，MMP12-/-小鼠的單核細胞數(shù)以及其百分數(shù)，均有降低趨勢且具有顯著差異。證明MMP12能影響單核細胞的分化，而巨噬細胞由單核細胞分化而來，所以我們假設MMP12影響單核細胞的分化而導致巨噬細胞的改變[18]。為了進一步驗證該假設，我們采用全血法流式細胞術檢測巨噬細胞。因為CD11b與F4/80是巨噬細胞表面特異性的標記,可利用二者雙陽性的細胞來識別和判斷巨噬細胞的變化。所以，我們利用流式細胞術檢測白細胞內(nèi)CD11b與F4/80雙陽性細胞來確定巨噬細胞的變化。簡單來說，將白細胞中單核細胞群進行設區(qū)域設門再進行分析(圖3A)。檢測結果顯示：與MMP12+/+小鼠相比，實驗組MMP12-/-小鼠白細胞中CD11b與F4/80雙陽性細胞百分比明顯下降(圖3B與3C),且有顯著性差異(*P<0.05，圖3D)。

注：A：血液巨噬細胞設門分析示意圖；B：對照小鼠血液中的CD11b與F4/80雙陽性細胞百分比流式代表圖；C：MMP12-/-小鼠血液中的CD11b與F4/80雙陽性細胞百分比代表圖；D：兩組小鼠血液中巨噬細胞百分比統(tǒng)計圖，即CD11b與F4/80雙陽性細胞的變化，*P<0.05。圖3 MMP12-/-與對照小鼠外周血中巨噬細胞流式檢測圖Note. A: Schematic diagram of blood macrophage gating analysis. B: The percentage of CD11b and F4/80 double-positive cells in the control mouse blood. C: The percentage of CD11b and F4/80 double-positive cells in MMP12-/- mouse blood. D: Statistical analysis of the percentage of macrophages in the blood of the two groups of mice, reflecting the changes in CD11b and F4/80 double-positive cells, *P < 0.05.Figure 3 Flow cytometry of macrophages in peripheral blood of the MMP12-/- and control mice

2.4 MMP12-/-小鼠脂肪組織中的巨噬細胞增多

小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠的腹部白色脂肪。4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，免疫組化染CD68。鏡檢可得，24周的MMP12-/-小鼠單個白色脂肪細胞面積遠大于MMP12+/+小鼠，且有顯著性差異(***P<0.001)。與MMP12+/+小鼠相比，24周的MMP12-/-小鼠的白色脂肪組織中大量CD68表達，對巨噬細胞的數(shù)量進行統(tǒng)計，且有顯著性差異(**P<0.01),結果如圖4。

注:A： MMP12-/-與對照小鼠脂肪組織的HE和IHC-CD68染色；B： MMP12-/-與對照小鼠脂肪細胞的大小，***P<0.001；C： MMP12-/-與對照小鼠脂肪組織中巨噬細胞表達量，**P<0.01。圖4 MMP12-/-與對照小鼠脂肪組織的HE和IHC染色(× 40)Note. A: MMP12-/- and control mouse adipose tissue subjected to HE and IHC-CD68 staining. B: MMP12-/-and control mouse fat cell size, ***P<0.001. C: The level of macrophages in adipose tissue of MMP12-/-and control mice, **P <0.01.Figure 4 Histology of MMP12-/- and control mouse adipose ttissues. HE and IHC staining

2.5 MMP12敲除對巨噬細胞的影響

上述結果提示巨噬細胞的變化可能與MMP12敲除有關。結果是MMP12敲除導致血液中單核細胞和巨噬細胞減少，白色脂肪中的巨噬細胞增多，圖5為其總結圖。

注：箭頭代表此細胞上升或下降趨勢。圖5 MMP12-/-小鼠巨噬細胞檢測總結Note. The arrow represents the rising or falling trend in the level of these cells.Figure 5 Summary of MMP12-/- mouse macrophage detection

3 討論

MMP12主要由巨噬細胞、單核細胞等炎性細胞分泌的一種內(nèi)切蛋白酶，幾乎能分解全部細胞外基質(zhì)成分和血管成分。本研究利用MMP12敲除小鼠，檢測小鼠血液的血常規(guī)，流式檢測其巨噬細胞的標記物。結果發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，單核細胞和巨噬細胞數(shù)目及其百分數(shù)血液內(nèi)含量降低，但是腹下白色脂肪內(nèi)的巨噬細胞含量增多。提示MMP12敲除會引起血液內(nèi)巨噬細胞數(shù)量變化和巨噬細胞在脂肪組織內(nèi)的分布。

MMP12缺失小鼠血液內(nèi)單核細胞的數(shù)量減少，巨噬細胞大部分屬于單核細胞來源，所以我們進一步利用流式細胞儀檢測巨噬細胞變化。在本次實驗中，我們對24周MMP12-/-小鼠和MMP12+/+小鼠進行檢測，沒有考慮其他時間點小鼠單核和巨噬細胞的變化，假設MMP12影響了血液細胞的發(fā)育，那么其他時間點我們認為是一致的，但是在本研究我們沒有檢測。在流式實驗設門時，以白細胞中的單核細胞進行設區(qū)域設門，選取巨噬細胞表面特異性標記物CD11b與F4/80雙陽性的細胞認為是巨噬細胞。研究結果顯示：與MMP12+/+小鼠對比，MMP12-/-小鼠白細胞中CD11b與F4/80雙陽性細胞百分比有明顯下降趨勢，且有顯著性差異，與上述結果MMP12敲除小鼠的血液單核細胞下降趨勢是一致的。這提示MMP12可以通過影響單核細胞的分化來改變巨噬細胞。

近年來，越來越多的證據(jù)表明：MMP12與脂代謝有關[19]。Heinecke等人[15]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MMP12缺失將促進脂肪組織的擴增和提高胰島素的敏感性，且在高脂喂養(yǎng)的條件下，敲除MMP12將導致小鼠的體重和體脂的增加。但MMP12敲除小鼠白色脂肪中巨噬細胞變化尚不清楚，在本研究中，我們?nèi)MP12-/-小鼠和MMP12+/+小鼠白色脂肪HE染色，免疫組化染CD68。鏡檢可得，24周的MMP12-/-小鼠單個白色脂肪細胞面積遠大于MMP12+/+小鼠，且白色脂肪組織中CD68大量表達。不足之處在于，我們沒有對高脂情況下脂肪組織中CD68表達進行檢測，但是國外研究也已經(jīng)證實高脂條件下飼養(yǎng)的MMP12敲除小鼠脂肪內(nèi)巨噬細胞的確是增多。

MMP12缺失可以減少外周血中的巨噬細胞數(shù)，增加白色脂肪中的巨噬細胞數(shù)量。目前，我們沒有檢測血液和脂肪中巨噬細胞各個亞型是如何變化的，只證明MMP12通過影響單核細胞的分化而改變巨噬細胞。然而，這一過程是如何引起變化的，其分子機制仍有待深入研究。

總之，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的變化可能與MMP12敲除有關，其意義在于發(fā)現(xiàn)了MMP12敲除可下調(diào)外周血中巨噬細胞數(shù)量及上調(diào)白色脂肪中巨噬細胞數(shù)量。這對于深入研究MMP12調(diào)控巨噬細胞變化機制有一定的意義[20]。