王程強(qiáng)，錢 波，陸艷玫，王 璐，張亞斌，宋家樂

(桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541000)

有機(jī)磷阻燃劑(organophosphate flame retardants，OPFRs)是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并能在環(huán)境中長期存在的新型阻燃劑。空氣、水體中的OPFRs會(huì)通過呼吸道、消化道進(jìn)入生物體內(nèi)[1]。隨著多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)類阻燃劑的禁用，OPFRs的使用量與日俱增。有研究顯示，多種環(huán)境介質(zhì)及生物體內(nèi)OPFRs檢出濃度逐年遞增[2]。OPFRs具有多種同系物，其中磷酸三(2-氯丙基)酯(tris(2-chloroisopropyl)phosphate，TCPP)是目前最常見的有機(jī)磷阻燃劑，而且在我國環(huán)境中廣泛存在[3]。近年來，大量研究證實(shí)OPFRs具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、發(fā)育毒性、致癌性[1]，其中以神經(jīng)毒性及甲狀腺干擾效應(yīng)最為顯著[4 - 5]。TCPP作為可疑的甲狀腺激素干擾物(TDCs)，可能會(huì)對甲狀腺激素產(chǎn)生干擾效應(yīng)[6]。甲狀腺激素功能的紊亂，會(huì)影響神經(jīng)及大腦的發(fā)育。因此，本研究以TCPP為受試物，通過對KM小鼠灌胃染毒，探索TCPP暴露對KM小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其血清甲狀腺激素水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4周齡KM小鼠，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK (桂) 2013-0001]，60只，雌雄各半，體質(zhì)量(26.6 ± 4) g。小鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK (桂) 2013-0001]，自由采食和飲水，室內(nèi)溫度20℃ ～ 25℃，濕度40% ～ 70%，12 h亮暗循環(huán)。本研究獲得桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(GLMC：201710020)。小鼠的飼養(yǎng)及使用過程嚴(yán)格遵守《美國公共衛(wèi)生署人道管理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物政策》[7]。KM小鼠在實(shí)驗(yàn)中處于舒適的環(huán)境，并為其提供足夠的水和食物，舒適的睡眠，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則對其給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

TCPP，產(chǎn)品批號(hào)YR160103(張家港瑞雅化工有限公司，純度> 99%)；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase，GST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(南京建成有限公司)；游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)產(chǎn)品編號(hào)54010224，游離四碘甲腺原氨酸(free tetraimethionine，F(xiàn)T4)產(chǎn)品編號(hào)75434094，總?cè)饧紫僭彼?total triiodothyronine，TT3)產(chǎn)品編號(hào)52607543，總四碘甲腺原氨酸(total tetraiodothyronine，TT4)產(chǎn)品編號(hào)75648910，按配套試劑盒操作說明檢測子鼠血清中T4、FT4、T3、FT3水平。甲狀腺激素測定采用德國西門子ADVIA Centaur XP全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)，使用的是直接化學(xué)發(fā)光法；Morris水迷宮檢測系統(tǒng)，產(chǎn)品型號(hào)XR-XM101(上海欣軟信息科技公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和處理

所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，分別為對照組和低、高染毒組，每組10只。將TCPP溶于純花生油中，根據(jù)各染毒組小鼠體質(zhì)量，按照10 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)體質(zhì)量灌胃染毒TCPP；對照組小鼠灌胃等體積花生油。連續(xù)灌胃染毒30 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法，每組選取小鼠8只，作為本實(shí)驗(yàn)的研究對象。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量及一般情況觀察

每天觀察記錄每組小鼠精神與活動(dòng)狀態(tài)，并于染毒后第28 ～ 30天，測量每組小鼠進(jìn)食量、飲水量和體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱重，處死小鼠取生物樣本并計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.3.3 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測定

染毒第30天后，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)[8]。將水迷宮等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共四個(gè)象限，平臺(tái)固定于第Ⅲ象限中部，錄像機(jī)懸掛于水迷宮正上方，記錄和分析動(dòng)物行為軌跡及動(dòng)物找到平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。實(shí)驗(yàn)前，所有子鼠進(jìn)行游泳預(yù)訓(xùn)練，2次/d。待適應(yīng)后，分別從Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ共四個(gè)象限面向水池放入子鼠，記錄子鼠在60 s內(nèi)的逃避潛伏期。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，將平臺(tái)至于水池水面下2 cm。若子鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則記錄其逃避潛伏期為60 s。第5天后，撤去水中的平臺(tái)，使子鼠從平臺(tái)外任一象限入水。記錄子鼠在60 s內(nèi)，在原平臺(tái)所在的象限游泳時(shí)間和跨越原平臺(tái)次數(shù)。子鼠的逃避潛伏期反映其空間學(xué)習(xí)記憶能力，子鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限時(shí)間反映其空間位置記憶能力。

1.3.4 小鼠血清甲狀腺激素水平檢測

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后當(dāng)天，各組小鼠采用苯巴比妥麻醉，1.0 mL注射器中心靜脈采血0.5 mL。4℃下，1500 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，分離血清，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定子鼠血清中游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、總?cè)饧紫僭彼?TT3)、游離四碘甲腺原氨酸(FT4)和總四碘甲腺原氨酸(TT4)水平[9]。

1.3.5 小鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

采血完畢后，斷頭處死小鼠，迅速剝離腦組織，1 mL生理鹽水洗凈血液后，立即置于-80℃液氮中保存待用。從液氮罐中取出腦組織解凍，以4℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗，剪碎組織后以組織搗碎機(jī)制備組織勻漿，3000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測腦組織中GST、SOD、CAT和MDA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

如表1、表2所示TCPP暴露對小鼠體質(zhì)量、飲食量以及其余臟器指數(shù)均沒有影響。但高劑量TCPP暴露后小鼠飲水量出現(xiàn)明顯降低，同時(shí)肝和脾臟器指數(shù)也出現(xiàn)顯著升高(P< 0.05)。

表1 不同劑量TCPP暴露對小鼠體質(zhì)量、飲食、飲水的影響

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表2 不同劑量TCPP暴露對小鼠臟器指數(shù)的影響

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

2.2 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化

如圖1、2、3所示，與對照組小鼠相比，低劑量TCPP染毒組小鼠僅逃避潛伏期出現(xiàn)延長。與對照組小鼠相比，高劑量TCPP染毒組小鼠逃避潛伏期和游行總路程出現(xiàn)明顯延長，在第三象限停留時(shí)間出現(xiàn)下降(P< 0.05)。

2.3 小鼠甲狀腺激素水平

如表3所示，與對照組小鼠相比，低劑量、高劑量TCPP染毒組小鼠FT3均出現(xiàn)明顯增高(P<0.05)。與對照組小鼠相比，高劑量TCPP染毒組小鼠TT3出現(xiàn)明顯增高(P< 0.05)。

注：與對照組相比，*P < 0.05。圖1 不同劑量TCPP暴露對小鼠逃避潛伏期的影響Note. Compared with the control group,*P< 0.05.Figure 1 Effects of TCPP exposure on escape latency of the mice

2.4 小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平

如表4所示，與對照組小鼠相比，低劑量TCPP染毒組小鼠僅GST出現(xiàn)降低，MDA增高(P< 0.05)。與對照組小鼠相比，高劑量TCPP染毒組小鼠GST、SOD出現(xiàn)明顯降低，MDA顯著增高(P< 0.05)。

注：與對照組相比，*P < 0.05。圖2 不同劑量TCPP暴露對小鼠游行總路程的影響Note. Compared with the control group,*P< 0.05.Figure 2 Effects of TCPP exposure on total swimming distance of the mice

表3 三組小鼠甲狀腺激素水平

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表4 三組小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

注：與對照組相比，*P < 0.05。圖3 不同劑量TCPP暴露對小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間的影響Note. Compared with the control group,*P< 0.05.Figure 3 Effects of TCPP exposure on residence time of the mice in the target quadrant

3 討論

OPFRs是由磷酸根骨架及三個(gè)取代基組成，根據(jù)取代基的種類，可以分為烷基OPFRs、芳基OPFRs、鹵代(主要是氯)烷基OPFRs三種。鹵代烷基OPFRs中又分為TCPP(磷酸三(2-氯丙基)酯)、TCEP(磷酸三氯乙酯)、TDCPP(磷酸三(2,3-二氯丙基)酯)、TDCIPP(磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯)。TCPP的化學(xué)結(jié)構(gòu)與TCEP、TDCPP、TDCPP、TDCIPP相似，均是氯化OPFRs，可以在環(huán)境中長期存在。TCPP是目前數(shù)量最多運(yùn)用最廣的氯化OPFRs，可能對環(huán)境生物和人體帶來巨大危害。目前，大量研究集中在TCPP對環(huán)境生物的影響。有研究表明，TCPP通過干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)來影響斑馬魚的發(fā)育[10]。TCPP暴露會(huì)導(dǎo)致秀麗線蟲生殖發(fā)育障礙、運(yùn)動(dòng)行為損傷和神經(jīng)毒性等[11]。通過大鼠垂體瘤細(xì)胞(GH3)增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TCPP對甲狀腺激素具有干擾效應(yīng)[6]。

然而TCPP對哺乳動(dòng)物的毒性研究很少。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP(100 mg/(kg·d))灌胃后小鼠飲水量出現(xiàn)降低，肝和脾臟器指數(shù)出現(xiàn)顯著升高。這一現(xiàn)象，與其同系物TDCIPP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分相似。Zhao等[12]用TDCIPP(100 mg/(kg·d)、250 mg/(kg·d))灌胃青春期雌性大鼠21 d，也出現(xiàn)肝臟器指數(shù)、(肝、腎臟器指數(shù))的增加。Moser等[13]用TDCIPP(150 mg/(kg·d))灌胃大鼠也出現(xiàn)了母鼠肝質(zhì)量的增加。這些結(jié)果說明，高劑量的TCPP暴露會(huì)對小鼠的生長和發(fā)育帶來不利的影響。但是皮天星等[10]用TCPP對成熟斑馬魚進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)肝指數(shù)隨著濃度的增加而降低。Fernie等[5]用TCPP等多種OPFRs(22 ng/g)染毒鳥類21 d，并未觀察鳥類肝出現(xiàn)氧化損傷，但是肝細(xì)胞的完整性和功能性發(fā)生適度的改變。以上結(jié)果的不同，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類和劑量、染毒方式的不同所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒組小鼠逃避潛伏期和游行總路程出現(xiàn)明顯延長，在第三象限停留時(shí)間出現(xiàn)下降，說明TCPP暴露后小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力出現(xiàn)明顯下降。這一結(jié)果說明，TCPP和其他氯化OPFRs一樣，具有明顯的神經(jīng)毒性。Tilson等[14]用TCEP急性短期(275 mg/kg)灌胃雌性大鼠，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力受損。這些結(jié)果與海馬椎體細(xì)胞大量減少有著密切的關(guān)聯(lián)。Umezu等[15]用TCEP急性短期(200 mg/kg)灌胃小鼠，小鼠自發(fā)性走動(dòng)活動(dòng)增加。這個(gè)結(jié)果可能是TCEP拮抗神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)有關(guān)。由于有機(jī)磷酸酯類阻燃劑在結(jié)構(gòu)上有與有機(jī)磷農(nóng)藥類似的磷酸二酯鍵，也有研究認(rèn)為OPFRs可能通過抑制膽堿酯酶產(chǎn)生神經(jīng)毒性[16]。但是對線蟲進(jìn)行TCEP或TCPP染毒會(huì)導(dǎo)致線蟲自主運(yùn)動(dòng)缺陷、帕金森樣運(yùn)動(dòng)障礙，引起多巴胺能神經(jīng)元退化[11]。TDCIPP對大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)染毒時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路[17]。上述研究雖然提出了研究OPFRs的神經(jīng)毒性機(jī)制的新方向，但多為體外或脊椎動(dòng)物，還需要進(jìn)一步在體內(nèi)和其他物種特別是哺乳動(dòng)物中進(jìn)一步探討。

甲狀腺激素在人類和動(dòng)物的生理過程中起到了重要作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育及各種功能形成過程中。因此，干擾甲狀腺激素將會(huì)對正常生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。由于TCPP的化學(xué)結(jié)構(gòu)與TT3和TT4結(jié)構(gòu)相似，因此TCPP可能對甲狀腺素產(chǎn)生干擾效應(yīng)，故被列為可疑甲狀腺激素干擾物(TDCs)。流行病學(xué)研究顯示，室內(nèi)粉塵中TDCIPP的含量與人體血清中FT4有著密切的關(guān)系，二者出現(xiàn)負(fù)相關(guān)[18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒組小鼠與對照組小鼠相比TT3、FT3出現(xiàn)明顯增高。同為氯代有機(jī)磷阻燃劑的TDCIPP對大鼠染毒，也出現(xiàn)了TT3增高的結(jié)論[12]。但是TDCIPP對雞胚、斑馬魚染毒，均出現(xiàn)了TT4減少的現(xiàn)象[19 - 20]，而本研究TT4未出現(xiàn)明顯改變。以上結(jié)論出現(xiàn)不同的原因，可能是因?yàn)?，相對于其他物種，哺乳動(dòng)物具有更好的免疫力和強(qiáng)大的自我調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)外界環(huán)境出現(xiàn)改變時(shí)，機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素(thyroid hormones，TH)水平會(huì)受到干擾。哺乳動(dòng)物往往比卵生動(dòng)物更快的啟動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制，如腦垂體和下丘腦的負(fù)反饋調(diào)節(jié)及甲狀腺代償機(jī)制來維持甲狀腺激素的穩(wěn)態(tài)。而且，卵生動(dòng)物與哺乳動(dòng)物有著不同的吸收、分布、代謝、排出的過程。卵生動(dòng)物免疫功能及外界環(huán)境抗干擾能力顯著低于哺乳動(dòng)物，所以卵生動(dòng)物比哺乳動(dòng)物更加敏感。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量染毒導(dǎo)致甲狀腺激素增高，可能是機(jī)體的補(bǔ)償機(jī)制。同為阻燃劑的多溴聯(lián)苯醚，也出現(xiàn)了類似的效應(yīng)。而且，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)甲狀腺激素的變化水平，往往比單個(gè)時(shí)間點(diǎn)甲狀腺激素水平更有意義。但是，由于本研究經(jīng)費(fèi)有限，因此沒有進(jìn)行多點(diǎn)檢測。

大腦是機(jī)體代謝最旺盛的器官，其抗氧化能力比較弱。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP暴露均可導(dǎo)致小鼠腦組織中MDA水平升高(P< 0.05)，GST和SOD活力下降(P< 0.05)，以及小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力出現(xiàn)明顯下降。說明氧化應(yīng)激在TCPP的神經(jīng)毒性中起到重要作用。有研究報(bào)道，較高濃度TCPP(100、150、200 μmol/L)對人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)細(xì)胞染毒時(shí)，相關(guān)細(xì)胞活力將受到抑制，其原因是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧、誘導(dǎo)DNA損傷及乳酸脫氫酶(LDH)大量滲出[21]。此外其同系物TDCIPP(30、60 μmol/L)對PC12細(xì)胞染毒時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧增多，SOD與GSH隨之劑量增高而降低，而MDA呈現(xiàn)增高的趨勢[22]。以上研究與本研究結(jié)果比較一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生神經(jīng)毒性及血清中TT3、FT3出現(xiàn)明顯增高。甲狀腺激素水平的增高，可以介導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致腦細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和腦細(xì)胞損傷的發(fā)生，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降[23]。綜上，TCPP暴露具有明顯的神經(jīng)毒性，其毒性機(jī)制可能與腦組織氧化損傷及甲狀腺激素紊亂有關(guān)。