張莉莎 米勝南 王 玲 委 剛 鄭堯杰 周 愷 尚麗娜 朱美丹 王 楠

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水稻短根白化突變體生理生化分析及基因定位

張莉莎 米勝南 王 玲 委 剛 鄭堯杰 周 愷 尚麗娜 朱美丹 王 楠*

西南大學(xué)水稻研究所/ 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715

葉色突變體是研究光合作用及葉綠素合成與降解途徑的理想材料, 有助于了解高等植物葉綠體發(fā)育和光合作用的調(diào)控機制。利用甲基磺酸乙酯(EMS)處理西農(nóng)1B, 獲得一個短根白化突變體(), 從出芽至第三葉期葉片始終為白色, 胚根較同時期野生型明顯變短。對相同位置的葉片觀察發(fā)現(xiàn), 西農(nóng)1B葉肉細(xì)胞葉綠體含量豐富且膜系統(tǒng)發(fā)育完整, 而葉肉細(xì)胞液泡化嚴(yán)重, 葉綠體數(shù)目明顯減少或沒有, 基粒類囊體垛疊松散且稀少。生理生化分析發(fā)現(xiàn)葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量接近于零, 凈光合速率為負(fù)值。遺傳分析表明該短根白化表型由單個隱性核基因控制, 最終將定位于水稻第3染色體長臂InDel標(biāo)記Z-20和Z-42間, 物理距離約657 kb, 是一個未報道的新基因。

水稻; 短根白化突變體; 基因定位

據(jù)統(tǒng)計, 水稻90%~95%碳水化合物由葉片光合作用產(chǎn)生, 葉綠體除了參與光合作用外, 還參與一些次生代謝物的合成[1]。通常情況下, 葉色突變體葉綠素含量降低導(dǎo)致光合作用效率下降進(jìn)而影響作物品質(zhì), 但有報道稱茶葉由于葉綠素含量降低表現(xiàn)出特殊品質(zhì)反而優(yōu)化了茶葉的種質(zhì)資源[2]。大多數(shù)葉色突變體在苗期就表現(xiàn)出肉眼可區(qū)分的性狀且突變類型多樣, 因此可以利用各種葉色突變體研究葉綠體發(fā)育分化機理、葉綠素生物合成和降解途徑、光合作用機制以及葉綠體結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)[3-4]。

高等植物葉綠體由不含片層結(jié)構(gòu)的前質(zhì)體, 經(jīng)組織分化、光誘導(dǎo)及葉綠體基因與核基因互作攝取必要蛋白和葉綠素最終發(fā)育而成。葉綠體基因分為3類: 第一類主要與光系統(tǒng)I (PSI)和光系統(tǒng)II (PSII)相關(guān), 包括編碼Rubisco大亞基(rbcL)、Rubisco小亞基(rbcS)和ATP酶的基因; 第二類主要包括DNA聚合酶基因、RNA聚合酶亞基基因、rRNA基因; 第三類包括NADH脫氫酶各亞基基因、轉(zhuǎn)運蛋白基因、固氮酶基因等。調(diào)控葉綠體基因表達(dá)至少需要兩類酶參與即核基因編碼的RNA聚合酶(NEP)和葉綠體基因編碼的RNA聚合酶(PEP)[5]。NEP主要負(fù)責(zé)管家基因如的轉(zhuǎn)錄; PEP具有多個亞基, 分別由葉綠體基因和編碼, 主要負(fù)責(zé)與光合作用相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[6]。葉綠體基因表達(dá)受阻導(dǎo)致植株葉色變異, 利用T-DNA插入得擬南芥突變體, 該基因突變造成轉(zhuǎn)錄本缺失, 導(dǎo)致葉片出現(xiàn)白化表型[7]。但是葉綠體自身編碼的蛋白較少, 大多數(shù)葉綠體蛋白由核基因編碼。水稻CFM3蛋白參與葉綠體基因和轉(zhuǎn)錄本的剪切, T-DNA插入得體內(nèi)和轉(zhuǎn)錄本不能被剪切,幼苗期致死且葉片始終表現(xiàn)白化[8]; 水稻AL1蛋白以劑量形式介導(dǎo)葉綠體發(fā)育, 輕微下調(diào)AL1表達(dá)幼苗能夠存活但葉片表現(xiàn)黃化, 而葉片白化[9]; T-DNA插入水稻第9個外顯子獲得, 葉片白化, 葉綠體被破壞[10]; 水稻核基因編碼一個多肽, 該多肽是葉綠體核糖體大亞基的一個組分,幼苗白化死亡, 幾乎檢測不到其葉綠素、葉綠素以及類胡蘿卜素含量[11]。

葉綠素的生物合成始于谷氨酰-tRNA合成酶催化谷氨酸與tRNA的結(jié)合, 從L-谷氨酞-tRNA合成葉綠素需14步酶促反應(yīng), 合成葉綠素需16步酶促反應(yīng)[12-13]。整個生物過程非常復(fù)雜, 由20多個基因編碼15種酶共同參與(附表1)[14-15], 包含谷氨酰-tRNA還原酶(HEMA)、鎂離子螯合酶(CHL)和葉綠素加氧酶1 (CAO1) 3個關(guān)鍵酶[16]。擬南芥編碼谷氨酰-tRNA還原酶基因突變后, 植株出現(xiàn)白化表型[17]。鎂離子螯合酶由I亞基、D亞基及H亞基組成, 該酶催化鎂離子插入原卟啉Ⅸ生成鎂原卟啉Ⅸ, 水稻基因編碼鎂離子螯合酶H亞基, 該基因突變出現(xiàn)白化致死表型[18], 水稻黃綠葉突變體分別由編碼鎂離子螯合酶D亞基和I亞基的基因突變所致[19]。水稻葉綠素加氧酶1 (CAO1)催化葉綠素轉(zhuǎn)化為葉綠素, T-DNA或Tos17插入獲得的突變體, 其葉色變淡、株高變矮[20]。此外, 葉綠素生物合成途徑中其他基因突變也會產(chǎn)生相應(yīng)的葉色突變體。植物血紅素對葉綠素含量具有反饋抑制作用, 過量的血紅素能抑制谷氨酰-tRNA還原酶的活性從而影響葉綠素的合成, 引起葉色變異[21]。類胡蘿卜素是一類多異戊間二烯化合物, 主要由胡蘿卜素和葉黃素組成的, 其生物合成受損可造成光氧化損傷和脫落酸ABA缺陷, ABA含量降低會出現(xiàn)穗發(fā)芽、葉片白化等表型[22]。

白化突變體的形成機制不盡相同, 但最終都會造成葉綠素代謝中某個或多個酶失活, 參與合成葉綠素、類胡蘿卜素等色素中的酶活性發(fā)生變化是目前發(fā)現(xiàn)較多的一類引起白化苗產(chǎn)生的原因[23]。我們利用化學(xué)誘變劑EMS處理西農(nóng)1B, 獲得一個苗期短根白化突變體, 通過分析光合色素含量、酶活性等生理參數(shù)以及遺傳分析和基因定位等實驗, 為候選基因的確定及進(jìn)一步功能分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

EMS處理秈稻西農(nóng)1B, 通過多代自交分離篩選出穩(wěn)定的短根白化突變體。由于三葉期致死, 從自交分離群體的正常株收種用于保存突變體, 并于次年分單株種植。田間材料按常規(guī)管理, 均種植于重慶北碚歇馬基地。

1.2 表型觀察及根系長度測定

從浸種出芽開始到突變體第三葉期死亡結(jié)束, 田間觀察野生型及突變體的葉色變化, 并在播種后第3、10、20 d隨機選取50株野生型單株和突變體單株測量根系長度, 取平均值。

1.3 葉綠體形態(tài)與結(jié)構(gòu)觀察

取三葉期長勢一致的野生型和突變體葉片, 將相同位置的葉片切成2 mm × 2 mm的小片, 根據(jù)洪建等人提出的方法包埋、切片及染色并觀察葉綠體的形態(tài)與結(jié)構(gòu)[24]。

1.4 光合色素含量的測定

取20株長勢相對一致的野生型和突變體, 分別稱取0.2 g葉片剪碎, 加入20 mL丙酮∶無水乙醇( 1∶1, v/v)混合液, 黑暗封口處理48 h, 期間搖動使其充分混勻。使用分光光度計測定波長在470 nm、645 nm、663 nm的光吸收值, 參考Wellburn方法計算光合色素含量[25], 對每個樣品重復(fù)3次, 取平均值。

1.5 光合特定參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

取長勢良好的野生型和突變植株, 測定葉片面積, 利用LI-6400型便攜式光合測定儀測定光合特性參數(shù)。材料經(jīng)暗適應(yīng)20 min后弱光照射測定初始熒光o, 用一定強度的飽和脈沖光照射0.8 s測定暗適應(yīng)最大熒光m; 材料光適應(yīng)30 min后打開光穩(wěn)態(tài)熒光, 用一定強度的飽和脈沖光照射0.8 s測定光適應(yīng)下最大熒光m′, 關(guān)閉飽和脈沖光打開遠(yuǎn)紅光測定光適應(yīng)最小熒光o′[26], 對每個樣品重復(fù)測定3次, 取平均值。

1.6 酶活性測定

剪取等量的野生型和突變體葉片, 參照南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒分別采取比色法、羥胺法、可見光法測定抗氧化過氧化物酶、總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性, 采取TBA法測定氧化降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。對每個樣品重復(fù)測定3次, 取平均值。

1.7 SRA1遺傳分析和基因定位

單株種植用于保存突變體而收獲的自交分離群體的種子, 隨機選取10個正常單株收種, 次年種植于北碚基地, 田間統(tǒng)計后代發(fā)生突變分離的株系中正常株與突變株的總數(shù), 進(jìn)行卡方驗證完成遺傳分析。

單株種植用于保存突變體而收獲的自交分離群體的種子, 隨機選取10個正常單株與秈稻西大1S (不育系)雜交得F1代種子, 次年單株種植F1種子獲得各單株的F2代種子, 播種并篩選出短根白化表型分離的群體作為連鎖分析群體。剪取F2等量的正常單株和突變單株的葉片, 采用CTAB法提取DNA分別構(gòu)建正常基因池和突變基因池, 同時采用CTAB法提取親本和F2代分離群體的DNA。用均勻分布于水稻12條染色體上的350對SSR引物和100對InDel引物, 以親本西大1S和突變親本的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和快速銀染法篩選出兩個親本間多態(tài)性分子標(biāo)記, 再利用該標(biāo)記分析正?；虺嘏c突變基因池之間的多態(tài)性, 對可能與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行F2隱性單株驗證。在確定該分子標(biāo)記連鎖后, 再在連鎖標(biāo)記附近尋找多態(tài)性分子標(biāo)記用于基因初步定位, 待連鎖區(qū)間確定后, 進(jìn)一步開發(fā)新的多態(tài)性分子標(biāo)記, 用于基因精細(xì)定位。用于基因定位的部分多態(tài)性引物(附表2)由上海英駿技術(shù)公司合成。

1.8 候選基因的預(yù)測

根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果, 利用基因預(yù)測網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search?tdsourcetag=spcqqaiomsg)對目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的基因進(jìn)行預(yù)測。

1.9 RNA的提取與cDNA的合成

用天根RNA prep pure Plant試劑盒提取野生型和突變體同一時期葉片的RNA, 用Invitrogen公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.10 定量RT-PCR表達(dá)分析

以為內(nèi)參, 使用SYBR Green染料實時熒光定量PCR分析葉綠體發(fā)育(葉綠體早期發(fā)育部分核基因)、葉綠素合成(光合色素合成部分基因)、光合作用(光合作用部分基因) 3個途徑中幾個基因的表達(dá)量(附表3)。用于定量分析的引物序列(附表4)由上海英駿技術(shù)公司合成。25 μL反應(yīng)體系含cDNA模板2 μL、10 μmol L–1上下游引物各2 μL、SYBR Green熒光染料12.5 μL、RNase-out H2O 8.5 μL。每個樣品重復(fù)3次, 在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR, 利用CFX-Manager軟件收集和處理數(shù)據(jù), 采用2–ΔΔCt的方法[27]計算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體和野生型表觀性狀比較

與野生型相比, 突變體從出芽(圖1-A~C)到第三葉期(圖1-D~E)葉片始終為白色, 且胚根較同時期野生型胚根明顯變短: 發(fā)芽后第3、第10、第20天突變體胚根長度分別下降了39.53%、37.75%和42.78% (圖2-H); 不定根數(shù)目與長度、胚根中部側(cè)根的平均長度和密度較野生型無明顯差異(圖2-I~J)。由于白化嚴(yán)重, 突變體三葉期后出現(xiàn)完全死亡現(xiàn)象, 暫時將該突變體命名為短根白化突變體()。

2.2 sra1葉綠體形態(tài)和結(jié)構(gòu)分析

利用透射電子顯微鏡對野生型和三葉期相同位置的葉片觀察發(fā)現(xiàn)(圖3), 野生型葉肉細(xì)胞液泡體積一定, 葉綠體數(shù)量豐富且膜系統(tǒng)發(fā)育完整, 其基粒類囊體清晰且排列較為整齊; 而植株葉肉細(xì)胞數(shù)目增多, 細(xì)胞體積變小, 液泡體積明顯增大, 葉綠體明顯變少或沒有, 內(nèi)部的基粒類囊體膜松散, 類囊體發(fā)育不完整, 只能觀察到類似于類囊體的間質(zhì)類囊體。

圖1 野生型(WT)和sra1表型特征

A~C: 萌發(fā)3 d野生型和植株; D: 萌發(fā)10 d野生型和植株; E: 萌發(fā)20 d野生型和植株; 標(biāo)尺: ABC中標(biāo)尺為1 cm, DE中標(biāo)尺為2 cm。

A–C: 3-day seeding of the wild type and the; D: 10-day seeding of the wild type and the; E: 20-day seeding of the wild type and the; Scale bars: 1 cm in A, B, and C, 2 cm in D and E.

(圖2)

A:萌發(fā)3 d野生型和植株根系; B:萌發(fā)10 d野生型和植株根系; C: 萌發(fā)20 d野生型和植株根系; D~G:萌發(fā)10 d野生型和胚根中部; 標(biāo)尺: 標(biāo)尺在ABC中為1 cm, DE中為0.5 cm, FG中為0.1 cm。H: 野生型和植株胚根長度; I:野生型和植株胚根中部側(cè)根長度; J: 野生型和植株側(cè)根密度。*顯著差異(< 0.005)。

A: 3-day seeding roots of the wild type and themutant; B: 10-day seeding roots of the wild type and themutant; C: 20-day seeding roots of the wild type and themutant; D–G: the middle of 10-day seeding roots of the wild type and themutant; Scale bars: 1 cm in A, B, and C, 0.5 cm in D and E, 0.1 cm in F and G. H: length of radicle of the wild type and themutant; I: length of lateral roots on the middle of radicle of the wild type and themutant; J: density of lateral roots of the wild type and themutant. *Significantly different at< 0.05 by-test.

圖3 野生型(WT)與sra1葉綠體透射電鏡觀察

1: 葉綠體; 2: 液泡; 3: 基粒; 4: 類囊體; 5: 間質(zhì)類囊體。A~C: 野生型植株葉綠體透射電鏡分析; D~F:植株葉綠體透射電鏡分析; 標(biāo)尺: A, D中標(biāo)尺為2 μm; B, E中標(biāo)尺為500 nm; C, F中標(biāo)尺為200 nm。

1: chloroplast; 2: cell vacuole; 3: grana lamella; 4: thylakoid; 5: stroma thylakoids-like. A–C: transmission electron microscopy observation of chloroplasts of wild type plants; D–F: transmission electron microscopy observation of chloroplasts ofplants; Scale: 2 μm in A and D, 500 nm in B and E, 200 nm in C and F.

2.3 sra1光合色素含量分析

圖4表明相比野生型,葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量接近于零, 這可能與其葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體急劇減少, 類囊體膜遭到破壞有關(guān)。

2.4 sra1光合特性參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)分析

凈光合速率為負(fù)值, 氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率較野生型分別下降40.00%和61.09%, 胞間CO2濃度極顯著升高(表1); 與野生型相比, 在暗適應(yīng)和光適應(yīng)條件下幾乎檢測不到的初始熒光和最大熒光(圖5), 這與葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素的含量接近于零的結(jié)果相一致。

2.5 sra1和野生型酶活性及MDA含量比較

SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子, 把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。機體內(nèi)的過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)會立即將其分解為完全無害的水。這3種酶組成一個完整的防氧化鏈條在機體中發(fā)揮著重要作用。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一, 它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷, 通過MDA了解膜脂過氧化程度以間接測定膜受損程度。圖6所示, 與野生型相比,葉片中SOD和POD活性分別升高397.89%和157.67%, CAT活性下降55.70%, MDA含量升高223.91%。說明葉肉細(xì)胞的葉綠體膜和類囊體膜受到極大程度的損傷。

圖4 野生型(WT)和sra1突變體光合色素含量

2.6 SRA1遺傳分析

隨機選取的10個正常單株收種, 田間統(tǒng)計后代發(fā)生突變分離的株系中正常株與突變株的分離, 發(fā)現(xiàn)3706株中, 正常單株2818株、短根白化單株888株, 經(jīng)卡平方測驗, 符合隱性基因3∶1的分離比例(χ2= 2.03 < χ20.05= 3.84), 表明的短根白化性狀受1對隱性核基因控制。

表1 野生型(WT)與突變體sra1光合特性

**在0.001水平上顯著差異。**Significantly different at< 0.001.

圖5 野生型(WT)與突變體sra1葉綠素?zé)晒鈪?shù)

A: 暗適應(yīng)條件下野生型和最大熒光量m和最小熒光量o; B: 光適應(yīng)條件下野生型和最大熒光量m′和最小熒光量o′。

A: maximum and minimum fluorescence amounts of wild type andunder dark adaptation; B: maximum and minimum fluorescence of wild type andunder light adaptation conditions.

圖6 野生型(WT)和sra1中SOD、POD、CAT活性和MDA含量

** 在0.001水平上顯著差異。**Significantly different at< 0.001.

2.7 SRA1基因定位

選取在親本西大1S和突變親本間出現(xiàn)多態(tài)性的引物擴(kuò)增正?；虺睾屯蛔兓虺? 第3染色體SSR標(biāo)記RM15177、RM3400和RM8208表現(xiàn)多態(tài)性。隨機選取32株F2代短根白化苗驗證連鎖, 并擴(kuò)大群體至208株縮小定位區(qū)間, 統(tǒng)計RM15177、RM3400和RM8208的重組子個數(shù)分別為13、12和6個, 遺傳距離分別為4.2、2.9和1.5 cM, 其中RM15177的重組子包含RM3400的重組子, 且RM3400和RM8208的重組子不同。因此初步把定位在SSR標(biāo)記RM3400和RM8208之間。初步定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計的60對InDel引物和30對SSR引物, 有6對在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性, 利用這6對多態(tài)性引物精細(xì)定位888株F2分離群體。最終將定位于第3染色體長臂InDel標(biāo)記Z-20和Z-42之間, 遺傳距離分別為0.05 cM和0.11 cM, 物理距離約為657 kb, InDel標(biāo)記Z-78和Z-83與基因發(fā)生共分離(圖7)。

圖7 SRA1基因在第3染色體上的基因定位圖譜

圖中的粗黑線代表染色體, 線上方標(biāo)記的是基因定位使用的SSR標(biāo)記, 線下方數(shù)值代表兩標(biāo)記間的遺傳距離,為F2定位群體總株數(shù)。

The thick black line in the figure represents the chromosome, the SSR markers used for gene mapping are marked above the line, the value below the line represents the genetic distance between the two markers, andis the total number of F2localized populations.

2.8 候選基因的預(yù)測

利用基因預(yù)測網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu. edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search?tdsourcetag=spcqqaiomsg)對基因預(yù)測顯示, 目標(biāo)區(qū)域共有101個基因,包含62個有功能的候選基因。其中大多數(shù)屬于反轉(zhuǎn)座子基因和轉(zhuǎn)座子基因, 還有一些基因表達(dá)酶蛋白或結(jié)構(gòu)域蛋白如肌醇-1-單磷酸酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、鋅指結(jié)構(gòu)域、RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。只有極少數(shù)基因如細(xì)胞色素P450、葉綠素/結(jié)合蛋白與光合作用相關(guān)。

2.9 相關(guān)基因的表達(dá)分析

基因突變可能影響到葉綠體發(fā)育、葉綠素合成、光合作用途徑中某些基因的表達(dá),葉綠體早期發(fā)育部分基因如核基因(編碼一個類似于維管蛋白結(jié)構(gòu)的原核細(xì)胞骨架GTP酶)、(編碼一個與原核DNA酶同源的DNA聚合酶)、(編碼NEP)、(RNA聚合酶β亞基)(鳥苷酸激酶2)(鳥苷酸激酶3)表達(dá)上調(diào)(圖8-A); 光合色素合成的部分基因如(谷氨酰-tRNA還原酶1)、(尿卟啉原-III合成酶)(鎂螯合酶D亞基)(鎂螯合酶M亞基)、(葉綠素加氧酶1)、(八氫番茄紅素合成酶1)(八氫番茄紅素合成酶2)表達(dá)下調(diào)(圖8-B); 光合作用的部分基因如(核酮糖二磷酸羧化酶大亞基)(核酮糖二磷酸羧化酶小亞基)和(PSII光捕獲葉綠素/結(jié)合蛋白1R和2R)、(光系統(tǒng)I葉綠素脫輔基蛋白)、(光系統(tǒng)II醌結(jié)合蛋白)、(細(xì)胞色素f亞基)(細(xì)胞色素b6亞基)在中幾乎檢測不到(圖8-C)。

光合作用的幾個基因在中幾乎不表達(dá), 很有可能是由于光合色素合成基因表達(dá)下調(diào)影響了光合色素的合成, 在光合色素缺乏的情況下無法轉(zhuǎn)錄光合作用相關(guān)的基因。葉綠體早期發(fā)育部分基因、、、在上調(diào)表達(dá), 說明葉綠體早期發(fā)育是正常的(透射電子顯微鏡觀察到有極少數(shù)量的葉綠體也證實了這一點), 但由于取材時葉綠體已經(jīng)處于完全形成期,中觀察不到完整的葉綠體。我們推測基因突變可能不影響葉綠體早期發(fā)育相關(guān)基因, 但可能影響其他葉綠體發(fā)育基因的表達(dá), 造成突變體葉綠體發(fā)育不完整, 無法進(jìn)行光合作用, 田間存活1個月后耗盡體內(nèi)營養(yǎng)最終凋亡。

圖8 野生型(WT)和sra1突變體相關(guān)基因的表達(dá)

A:野生型和sra1植株葉綠體早期發(fā)育部分基因、、、、、表達(dá)量; B: 野生型和sra1植株光合色素合成部分基因、、、、、、表達(dá)量; C: 野生型和植株光合作用部分基因、、、、、、、表達(dá)量。

A: expression levels of,,,,,in the wild type and; B: expression levels ofin the wild type and; C: expression levels ofin the wild type and.

3 討論

近年來, 葉色突變體具有一定研究價值而備受關(guān)注, 國內(nèi)外己報道80多個水稻苗期葉色突變, 在12條染色體上均有分布, 但是僅有少數(shù)被具體定位和克隆出來[28]。白化突變體葉綠體體積變小,具有雙層膜結(jié)構(gòu)但基質(zhì)中沒有片層結(jié)構(gòu), 只有淀粉粒、脂肪粒以及一些類似于前質(zhì)體的結(jié)構(gòu), 該基因定位到第2染色體分子標(biāo)記R2M501和R2M502之間約280 kb范圍內(nèi)[29]。白化致死突變體葉片從發(fā)芽至三葉期一直表現(xiàn)為白化, 三葉期后逐漸死亡,透射電鏡觀察葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞, 導(dǎo)致無法進(jìn)行光合作用而死亡, 圖位克隆最后將定位于第4染色體201 kb范圍內(nèi)[30]。白化致死突變體葉片幼苗期表現(xiàn)為白化, 四葉期后死亡, 結(jié)合SSR和InDel分子標(biāo)記將基因定位在第1染色體長臂分子標(biāo)記P4和P6之間, 最后證實該基因編碼質(zhì)體核糖體小亞基S20蛋白[31]。

我們通過EMS處理西農(nóng)1B得到, 葉片從出芽到第三葉期始終表現(xiàn)為白化且胚根長度明顯變短, 這在已報道過的水稻白化苗中是少有的現(xiàn)象, 并且在已報道的短根表型中也很少出現(xiàn)白化表型。水稻突變體在正常培養(yǎng)條件下表現(xiàn)短根、開花延遲和部分不育, 切片分析發(fā)現(xiàn)根部細(xì)胞縱向變短, 伸長區(qū)細(xì)胞皺縮。突變體蔗糖含量增加而己糖含量降低, 外施葡萄糖能恢復(fù)其根部的生長[32]。編碼中性/堿性轉(zhuǎn)化酶催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖, 是水稻根發(fā)育中提供能量的重要酶類,短根表型受一個隱性基因控制, 一個核苷酸替換導(dǎo)致其編碼的蛋白從Gly變成Arg[33]。

我們推測葉綠體早期發(fā)育正常, 后期由于突變影響到光合色素的合成, 植株無法進(jìn)行有效的光合作用待體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡后死亡。胚根明顯變短可能是根部營養(yǎng)向葉部運輸使得根部營養(yǎng)缺乏, 胚根無法正常生長。前人報道的白化致死突變體最終均只與葉綠體缺陷有關(guān), 并未出現(xiàn)短根表型, 而我們獲得突變體胚根明顯變短, 因此推測可能是一個新型的短根白化致死突變體,基因可能同時參與水稻葉綠體及主根發(fā)育, 但是關(guān)于突變體真正形成機制還需要進(jìn)一步分析和研究。

4 結(jié)論

()自出芽到第三葉期葉片始終表現(xiàn)為白色且胚根變短, 葉綠體極少或沒有, 葉綠體膜和類囊體膜受到極大程度的損傷, 葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量幾乎為零, 無法進(jìn)行有效的光合作用。該短根白化性狀由單個隱性核基因控制,基因位于水稻第3染色體長臂InDel標(biāo)記Z-20和Z-42之間, 物理距離約657 kb, 推測是一個新型的短根白化致死突變體,基因可能同時參與水稻葉綠體及主根發(fā)育。

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附表1 編碼被子植物葉綠素合成途徑關(guān)鍵酶的基因

Supplementary table 1 Gene encoding the enzymes in the chlorophyll biosynthetic pathway inangiosperm

(續(xù)附表1)

編號Code酶Enzyme基因Gene水稻Rice 10鎂螯合酶D亞基Mg chelatase D subunitCHLDAK072463 鎂螯合酶H亞基Mg chelatase H subunitCHLHAK067323 鎂螯合酶I亞基Mg chelatase I subunitCHLIAK060389 11鎂原卟啉IX甲基轉(zhuǎn)移酶Mg-protoporphyrin IX methyltransferaseCHLMAK059151 12鎂原卟啉 IX單甲酯環(huán)化酶Mg-protoporphyrinogen IX monomethylester cyclaseCHL27AK069333 13二乙烯還原酶3,8-divinyl reductase protochlorophyll a-8-vinyl reductaseDVRAK103940 14原葉綠素酸酯氧化還原酶Protochlorophyllide oxidoreductasePORAK068143 15葉綠素合酶Chlorophyll synthaseCHLGAK068855 16葉綠素a加氧酶1 Chlorophyllide a oxygenaseCAO1AF284781/AK063367

附表2 用于基因定位的部分多態(tài)性引物序列

Supplementary table 2 Sequences of some discrepant primers for gene mapping

附表3 定量PCR的相關(guān)基因描述

Supplementary table 3 Related quantitative gene description

(續(xù)附表3)

基因Gene基因產(chǎn)物ProductRAP位點RAP_locus PSY2Phytoene synthase 2Os12g0626400 carb1RChlorophyll A/B binding protein 1ROs09g0346500 carb2RChlorophyll A/B binding protein 2ROs01g0600900 petApetA, cytochrome fCAA33961 petBpetB, cytochrome B6CAA33977 psaApsaA, PSI P700 apoprotein A1CAA33996 psbApsbA, PSII 32 kDa proteinCAA34007 RbcLRbcL,Ribulose bisphosphate carboxylase large chainCAA34004 RbcSRubisco small subunitOs12g0274700

附表4 用于定量的引物序列

Supplementary table 4 Sequences of primers for RT-PCR

Physiological and biochemical analysis and gene mapping of a novel short radicle and albino mutantin rice

ZHANG Li-Sha, MI Sheng-Nan, WANG Ling, WEI Gang, ZHENG Yao-Jie, ZHOU Kai, SHANG Li-Na, ZHU Mei-Dan, and WANG Nan*

Rice Research Institute, Southwest University / Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

The leaf color mutant is an ideal material for studying the process of photosynthesis and the pathways of chlorophyll synthesis and degradation. Studies on rice leaf color mutants are helpful to explain the gene network of chloroplast development and photosynthesis in higher plants. The mutant, derived from the progeny of EMS-treatedrice Xinong 1B. Leaves ofwere white in color from budding to the third leaf, and the radicle ofwas significantly shorter than that of wild type in the same stage. The observation of leaves in the same position showed that in Xinong 1B, the chloroplast of mesophyllous cells was abundant and the membrane system was fully developed, while in, the vacuolarization of mesophyll cells was serious, the number of chloroplasts was significantly reduced or absent, and the granule thylakoids were loosely folded. The contents of chlorophyll, chlorophyll, and carotenoid inwere close to zero, and the net photosynthetic rate was negative. Genetic analysis indicated that the short-root and albino phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene, andwas loca-lized between the long-arm InDel markers Z-20 and Z-42 of rice chromosome 3. The physical distance between the two InDel markers was about 657 kb. No genes related to chloroplast and root development have been reported in this interval, indicating thatis a novel mutant. Theis a novel mutant with albino and accompanying short roots, suggesting thatmay be involved in regulating chloroplast and root development.

rice; short radicle and albino mutant; gene mapping

): 2018-07-29;

2018-12-24;

2019-01-07.

10.3724/SP.J.1006.2019.82041

王楠, E-mail: wangnan_xndx@126.com

E-mail: 985959967@qq.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31771750)和重慶市基礎(chǔ)研究與前沿探索項目(cstc2018jcyjAX0424)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31771750) and the Basic Research and Frontier Exploration Projects of Chongqing City (cstc2018jcyjAX0424).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20190103.0929.007.html