張春宵 李淑芳 金峰學(xué) 劉文平 李萬軍 劉 杰,3 李曉輝,*

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用3種方法定位玉米萌發(fā)期和苗期的耐鹽和耐堿相關(guān)性狀QTL

張春宵1李淑芳1金峰學(xué)1劉文平1李萬軍2劉 杰1,3李曉輝1,*

1吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所, 吉林公主嶺 136100;2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院洮南綜合試驗(yàn)站, 吉林洮南 137100;3延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林延吉 133400

以耐鹽堿鄭58和鹽堿敏感昌7-2為親本, 構(gòu)建包含151份F2:5重組自交系(RILs)群體?；?K芯片對(duì)鄭58、昌7-2及其F2:5家系進(jìn)行基因型分析, 構(gòu)建了包含1407個(gè)SNP分子標(biāo)記的高密度遺傳連鎖圖譜。該圖譜的各染色體標(biāo)記數(shù)在84~191之間, 標(biāo)記間的平均距離為0.81 cM。脅迫液為200 mmol L–1NaCl和100 mmol L–1Na2CO3, 對(duì)照液為蒸餾水或霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液, 對(duì)鹽、堿脅迫和自然條件下玉米的發(fā)芽率(GP)、株高(PH)、植株干、鮮重(FW、DW)、幼苗組織含水量(TWS)、植株地上部分鈉含量(SNC)、鉀含量(SKC)、鈉/鉀含量比(NKR)、苗期耐鹽率(STR)、耐堿率(ATR) 10項(xiàng)指標(biāo), 采用3種不同的作圖方法同時(shí)定位研究, 對(duì)加性QTL定位采用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)和完備區(qū)間作圖法(ICIM), 對(duì)加性QTL與環(huán)境互作聯(lián)合分析采用混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法(MCIM)。結(jié)果表明, (1)與對(duì)照條件下各性狀表型值相比, 耐堿相關(guān)性狀的降低較耐鹽相關(guān)性狀明顯, 說明玉米對(duì)堿脅迫更加敏感和堿脅迫對(duì)玉米的傷害更嚴(yán)重。堿與鹽脅迫下SKC相當(dāng)而SNC差異較大, 表明Na+、K+的吸收和運(yùn)輸是相互獨(dú)立的兩個(gè)過程, 玉米鹽、堿脅迫可能是兩種性質(zhì)不同的脅迫。(2)在自然、鹽和堿脅迫條件下, 運(yùn)用CIM分別檢測(cè)到27、28、40個(gè)加性QTL; 運(yùn)用ICIM分別檢測(cè)到28、23、17個(gè)加性QTL; 運(yùn)用MCIM共檢測(cè)到11個(gè)耐鹽加性QTL、4個(gè)環(huán)境互作QTL以及11個(gè)耐堿加性QTL、3個(gè)環(huán)境互作QTL。(3)鹽脅迫條件下的、、、和堿脅迫條件下的、能被3種作圖方法重復(fù)檢測(cè)到。與前人結(jié)果比較,、、、定位在相同或鄰近區(qū)域,尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果為精細(xì)定位玉米耐鹽堿主效基因、挖掘候選基因和開發(fā)用于標(biāo)記輔助選擇的實(shí)用功能標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

玉米; 萌發(fā)期; 苗期; 鹽/堿脅迫; QTL定位

玉米(L.)的種植面積已躍居我國(guó)糧食作物首位[1], 高產(chǎn)及穩(wěn)產(chǎn)對(duì)國(guó)家糧食安全起到至關(guān)重要的作用。我國(guó)的可耕地面積逐漸縮小, 過量施肥、不合理灌溉及環(huán)境惡化等多種因素導(dǎo)致土壤鹽堿化加重, 鹽堿地面積已逾6.7×106hm2, 成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的第二大災(zāi)害, 同時(shí)也成為當(dāng)前阻礙玉米生產(chǎn)的“瓶頸”[2]。圍繞耐鹽堿相關(guān)性狀, 定位主效基因并培育具有鹽堿抗性的品種是解決上述問題的最有效途徑, 意義重大。

近年來, 國(guó)內(nèi)外已圍繞耐鹽堿性狀相繼開展了QTL定位研究。管飛翔等[3]利用RA×M5P構(gòu)建F6分離群體, 在鹽、堿、對(duì)照3種環(huán)境下, 共檢測(cè)到10個(gè)與相對(duì)胚根長(zhǎng)、相對(duì)胚芽長(zhǎng)相關(guān)的QTL, 響應(yīng)鹽脅迫的2個(gè)QTL分別位于第1、第7染色體, 響應(yīng)堿脅迫的3個(gè)QTL分別位于第1、第3染色體, 對(duì)照條件下檢測(cè)到5個(gè)QTL分別位于第1、第2、第6、第8、第10染色體。王士磊等[4]選用黃早四與Mo17雜交, 構(gòu)建F7及F8, 以250 mmol L–1NaCl為脅迫溶液, 共檢測(cè)到6個(gè)與存活時(shí)間、株高變化率、干/鮮重變化率等性狀相關(guān)的QTL, 它們分別位于第1、第5、第6染色體。馬曉軍等[5]利用耐堿鄭58×堿敏感昌7-2構(gòu)建的F2分離群體, 在100 mmol L–1Na2CO3溶液脅迫下調(diào)查玉米幼苗耐堿率, 共檢測(cè)到4個(gè)位于第2、第5、第7染色體上的QTL。吳丹丹[6]采用9個(gè)表型性狀, 包括鮮重(SFW)、干重(SDW)、出苗率(FGR)、組織含水量(TWC)、耐鹽指數(shù)(STR、FSTR)、鈉、鉀含量比(SNC/SKC)、地上鈉離子含量(SNC)、地上鉀離子含量(SKC)等, 共檢測(cè)到20個(gè)加性QTL與鹽脅迫相關(guān), 且分布于玉米7條染色體上, 能夠解釋0.98%~58.33%的變異范圍, 其中有5個(gè)QTL解釋的變異率達(dá)到20%以上。Mohammad[7]利用鹽敏感材料B73×耐鹽CZ-7構(gòu)建的F2群體, 在對(duì)照和200 mmol L–1NaCl脅迫下調(diào)查莖長(zhǎng)(SL)、根長(zhǎng)(RL)、莖/根長(zhǎng)度比(RRLSL)、地上部分鮮重(SFW)、根鮮重(RFW)、植物鮮重(PFW)、地上部分干重(SDW)、根干重(RDW)、植株干重(PDW)、地上部分/根干重(RRDWSDW) 10個(gè)性狀, 得到16個(gè)正常條件下和25個(gè)鹽脅迫條件下的QTL, 其中14個(gè)QTL可解釋10%的表型變異。Luo等[8]以PH6WC和PH4CV構(gòu)建240個(gè)DH系的作圖群體, 分別在鹽池和正常土壤下調(diào)查株高并計(jì)算耐鹽指數(shù), 共檢測(cè)到26個(gè)QTL, 在第1染色體上檢測(cè)到鹽土植株高度(SPH)主效QTL, 可解釋表型變異的31.2%。

土壤鹽堿化相伴而生, 通常包括以土壤鹽度升高為特征的鹽化和以土壤pH升高為特征的堿化[9]。盡管玉米對(duì)鹽、堿的耐性高度相關(guān), 但堿對(duì)玉米的傷害程度高于鹽。關(guān)于玉米苗期耐鹽性QTL定位的文章已有大量報(bào)道, 但鮮有關(guān)于玉米耐堿性QTL的。本研究利用同一套試材, 分別開展耐鹽性、耐堿性遺傳機(jī)制的研究, 力求全面揭示玉米耐鹽堿遺傳機(jī)制, 以利玉米耐鹽堿育種。

1 材料與方法

1.1 材料

以全國(guó)種植面積連續(xù)10年一直保持在3.30×106hm2以上的玉米雜交種鄭單958的雙親, “耐鹽堿型”鄭58和“鹽堿敏感型”昌7-2雜交并通過“單粒傳”獲得的151份F2:5重組自交系作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院公主嶺試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2.1 萌發(fā)試驗(yàn) 以151份家系及雙親為試驗(yàn)材料, 從每份材料取30粒種子, 設(shè)3次重復(fù), 分別于鹽脅迫處理液(200 mmol L–1NaCl)、堿脅迫處理液(100 mmol L–1Na2CO3, pH 11.17)及對(duì)照(蒸餾水)中。于光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng), 溫度為25℃, 濕度為60%。

1.2.2 苗期試驗(yàn) 151份家系及雙親每份選取30粒種子、3次重復(fù), 種植于裝有蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽(直徑9 cm), 置光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為16 h光照及8 h黑暗交替, 濕度為60%, 溫度為(25±2)℃/(20±2)℃晝/夜交替, 光強(qiáng)為50~60 μmol m–2s–1。待幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí), 使用鹽脅迫液(200 mmol L–1NaCl)或堿脅迫液(100 mmol L–1Na2CO3)澆灌, 對(duì)照為澆灌霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液, 以蛭石持水量的2倍為澆灌量。

1.3 表型測(cè)定

1.3.1 萌發(fā)試驗(yàn) 培養(yǎng)7 d后測(cè)定151份家系及雙親發(fā)芽率。遵照《糧油檢驗(yàn)發(fā)芽試驗(yàn)GB/T 5520-2011》, 以幼根達(dá)籽粒長(zhǎng)、幼芽至少達(dá)籽粒長(zhǎng)的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn), 調(diào)查記載種子的發(fā)芽率[10]。

1.3.2 苗期試驗(yàn) 脅迫4 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)每個(gè)家系及親本的苗期耐鹽率(STR)或耐堿率(ATR)。用數(shù)字0~5級(jí)來表示幼苗葉片的鹽堿傷害程度, 統(tǒng)計(jì)F2:5重組自交系耐鹽堿指數(shù)。0級(jí), 幼苗生長(zhǎng)正常, 沒有鹽堿害癥狀; 1級(jí), 幼苗生長(zhǎng)受鹽堿害較輕, 僅葉尖焦枯; 2級(jí), 幼苗30%的葉片枯黃或失綠; 3級(jí), 幼苗50%的葉片枯黃或失綠; 4級(jí), 幼苗大部分枯黃僅心葉綠; 5級(jí), 幼苗完全枯死[11]。

以幼苗地上部分伸直后最高點(diǎn)的高度為株高(PH)[12]。

取完整植株, 用蒸餾水快速?zèng)_洗掉蛭石和灰塵, 濾紙吸干植株表面殘留水分, 稱鮮重(FW), 放入烘箱中, 105℃殺青20 min后80℃烘干至恒重, 稱干重(DW)[13]。

根據(jù)稱得的鮮重、干重, 計(jì)算玉米幼苗組織含水量(TWC)[14]。

將烘干后的地上部分磨成粉末, 采用火焰分光光度計(jì)法, 測(cè)定幼苗的地上部分鈉含量(SNC)、鉀含量(SKC)、鈉/鉀含量比(NKR)。

1.4 基因分型和連鎖圖譜構(gòu)建

采用CTAB法提取151份F2:5重組自交系及雙親本葉片DNA, 通過瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢測(cè)DNA的質(zhì)量。對(duì)符合要求的DNA樣品, 通過MaizeSNP 3072微陣列[15]進(jìn)行基因型分析。對(duì)具有多態(tài)性的SNPs數(shù)據(jù), 使用QTL IciMapping 3.3[16]構(gòu)建遺傳連鎖圖譜, 設(shè)置最小LOD值為3.0, 且用Kosambifunction[17]功能來啟動(dòng)程序, 用厘摩(cM)來表示圖譜上標(biāo)記的間距。

1.5 數(shù)據(jù)分析及QTL定位

依靠SPSS 22.0軟件(SPSS Inc, Chicago, USA)統(tǒng)計(jì)分析表型數(shù)據(jù)和檢驗(yàn)相關(guān)性。分別利用QTL Cartographer 2.5軟件[18]、QTL IciMapping v3.3軟件及QTL Network 2.1[9]軟件中的復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM, composite interval mapping)、完備區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping, ICIM)和基于混合線性模型的復(fù)合區(qū)間作圖法(mixed composite interval mapping, MCIM)進(jìn)行耐鹽或耐堿QTL定位分析。采用CIM和ICIM進(jìn)行加性QTL定位時(shí), 設(shè)閾值LOD=2.5, 采用MCIM進(jìn)行耐鹽性或耐堿性相關(guān)性狀定位加性QTL及QTL與處理間的互作時(shí)設(shè)臨界閾值=0.05。參照McCouch等[20]的方式命名上述QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型變異與性狀相關(guān)分析

表1表明, 對(duì)照條件下, 6個(gè)指標(biāo)GP、PH、FW、DW、TWC、SKC在雙親間差異不大, 均未達(dá)到顯著水平。鹽脅迫條件下, 6個(gè)指標(biāo)PH、FW、STR、SKC、SNC、NKR在雙親間表現(xiàn)出顯著或極顯著差異; 堿脅迫條件下, 8個(gè)指標(biāo)GP、PH、FW、DW、ATR、SKC、SNC、NKR在雙親間表現(xiàn)出顯著或極顯著差異, 二者均為QTL分析提供了較好的遺傳背景; 脅迫條件下, SNC、NKR等指標(biāo)值均大于對(duì)照值。而鹽、堿脅迫條件下, 除了TWC其余性狀各表型值的變異系數(shù)均超過10%, 且存在超親分離家系。除了鹽脅迫條件下的TWC外, 其余性狀各表型值基本符合正態(tài)分布, 峰度、偏斜度的絕對(duì)值≤1.0 (圖1~圖3)。

2.2 玉米苗期鹽/堿脅迫條件下相關(guān)表型性狀的相關(guān)分析

綜合分析圖1至圖3, 堿脅迫與鹽脅迫條件下GP間呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.67; 在堿脅迫條件下, PH與鹽脅迫下PH、FW、DW呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)依次為0.49、0.37、0.33; 在堿脅迫條件下, FW與鹽脅迫下PH、FW、DW呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)依次為0.45、0.40、0.39; 在堿脅迫條件下, DW與鹽脅迫下PH、FW、DW呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)依次為0.46、0.43、0.46。與對(duì)照條件下各性狀表型值相比, 耐堿相關(guān)性狀降低較耐鹽明顯, 堿脅迫下ATR降低幅度大于鹽脅迫下STR, 表明與鹽脅迫相比, 玉米對(duì)Na2CO3脅迫更加敏感且傷害更嚴(yán)重。兩脅迫下SKC相當(dāng)而SNC差異較大, 說明Na+、K+的吸收和運(yùn)輸是相互獨(dú)立的兩個(gè)過程, 玉米鹽、堿脅迫可能是兩種性質(zhì)不同的脅迫。

表1 苗期151個(gè)家系以及親本在對(duì)照、鹽及堿處理?xiàng)l件下各性狀的表型值

*表示0.05概率水平差異顯著;**表示0.01概率水平差異顯著。GP: 發(fā)芽率; PH: 株高; FW: 地上鮮重; DW: 地上干重; TWC: 組織含水量; SRT: 耐鹽率; ATR: 耐堿率; SKC: 鉀含量; SNC: 鈉含量; NKR: 鈉鉀比; N: 對(duì)照; S: 200 mmol L–1NaCl脅迫; A: 100 mmol L–1Na2CO3脅迫。

*Significant at the 0.05 probability level.**Significant at the 0.01 probability level. GP: germination percentage; PH: plant height; FW: shoot fresh weight; DW: shoot dry weight; TWC: tissue water content; STR: salt tolerance rating; ATR: alkaline tolerance rating; SKC: shoot K+concentration; SNC: shoot Na+concentration; NKR: shoot Na+/K+ratio; N: normal treatment; S: 200 mmol L–1NaCl treatment; A: 100 mmol L–1Na2CO3treatment.

圖1 F2:5群體對(duì)照條件下相關(guān)性狀的相關(guān)性分析與頻數(shù)分布

*和**分別表示在5%和1%; NS: 不顯著; 縮寫同表1。

* and ** significant at the 5% and 1% probability levels, respectively; NS: no significant.Abbreviations are the same as those given in Table 1.

圖2 F2:5群體鹽脅迫條件下耐鹽相關(guān)性狀的相關(guān)性分析與頻數(shù)分布

*和**分別表示在 5%和1%水平顯著性; NS: 不顯著; 縮寫同表1。

* and ** significant at the 5% and 1% probability levels, respectively; NS: no significant.Abbreviations are the same as those given in Table 1.

圖3 F2:5群體堿脅迫條件下耐堿相關(guān)性狀的相關(guān)性分析與頻數(shù)分布

*和**分別表示在5%和1%水平顯著性; NS: 不顯著; 縮寫同表1。

* and ** significant at the 5% and 1% probability levels, respectively; NS: no significant.Abbreviations are the same as those given in Table 1.

2.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

用151個(gè)F2:5RILs群體構(gòu)建連鎖圖譜, 從3072個(gè)SNP標(biāo)記中篩選出1407個(gè)有效多態(tài)性標(biāo)記, 使用IciMapping 3.3軟件繪圖(圖4), 該圖譜總長(zhǎng)度1145.42 cM, SNP標(biāo)記分布于玉米10條染色體上, 各染色體標(biāo)記數(shù)是84~191個(gè), 標(biāo)記間的平均距離為0.81 cM。

2.4 玉米耐鹽、耐堿相關(guān)性狀的QTL定位分析

2.4.1 利用CIM對(duì)玉米耐鹽、耐堿相關(guān)性狀的QTL定位分析 在3種條件下, 分別檢測(cè)到27、28、40個(gè)加性QTL (附表1)。在自然條件下, 27個(gè)QTL分布于玉米第1~第7和第9染色體, LOD值在2.6~17.9之間, 能夠解釋2.3%~26.2%的變異; 在鹽脅迫條件下, 28個(gè)QTL遍布于玉米10條染色體, LOD值在2.5~7.3之間, 能夠解釋2.0%~11.4%的變異; 在堿脅迫條件下, 40個(gè)QTL遍布于玉米10條染色體, LOD值在2.6~9.3之間, 能夠解釋2.1%~25.4%的變異。

2.4.2 利用ICIM對(duì)玉米耐鹽、耐堿相關(guān)性狀的加性QTL定位分析 由附表2可知, 在自然條件下, 共檢測(cè)到遍布于玉米10條染色體上的28個(gè)QTL, LOD值分布在2.7~9.6之間, 分別解釋性狀變異的1.5%~14.4 %; 在鹽脅迫條件下, 共檢測(cè)到遍布于玉米第1~第3、第5~第9染色體上的23個(gè)QTL, LOD值分布在2.7~7.1之間, 分別解釋性狀變異的1.0%~12.1%; 在堿脅迫條件下, 共檢測(cè)到遍布于玉米第2、第3、第5、第8和第9染色體上的17個(gè)QTL, LOD值分布在2.5~ 5.2之間, 分別解釋性狀變異的1.3%~16.3%。

2.4.3 利用MCIM對(duì)玉米耐鹽、耐堿相關(guān)性狀的QTL定位分析 在鹽脅迫條件下, 共檢測(cè)到11個(gè)加性QTL及4個(gè)環(huán)境互作QTL, 遍布于玉米除第10染色體外的其余染色體上, 分別解釋性狀變異的3.1%~13.8 %。在堿脅迫條件下, 共檢測(cè)到11個(gè)加性QTL及3個(gè)環(huán)境互作QTL, 遍布于玉米第1~第4、第7~第9染色體上, 分別解釋性狀變異的1.1%~11.5% (附表3)。

2.4.4 3種QTL作圖方法耐鹽定位結(jié)果比較 基于上述3種QTL作圖方法, 比較全部耐鹽、耐堿定位結(jié)果(表2、表3和圖4)。在自然及鹽脅迫條件下,、、與能被3種作圖方法重復(fù)檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率分別為6.26%~ 13.79%、2.73%~11.09%、4.52%~8.14%和5.54%~ 11.02%。在自然及堿脅迫條件下,與能被3種作圖方法重復(fù)檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率分別為9.59%~11.53%和4.61%~10.46%。

圖4 基于SNP標(biāo)記的玉米遺傳連鎖圖譜

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對(duì)玉米苗期表型性狀的影響

土壤鹽堿化影響作物的正常生理代謝和生理活動(dòng), 主要表現(xiàn)在離子毒害、滲透脅迫和營(yíng)養(yǎng)吸收不平衡等方面。從萌發(fā)到成熟的各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段, 玉米均受到不同程度鹽堿危害, 尤其在生長(zhǎng)發(fā)育前期(萌發(fā)期和苗期)對(duì)脅迫最為敏感。鹽堿脅迫下, 影響細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng), 葉片失綠、植株生長(zhǎng)緩慢, 根系相對(duì)活力降低, 相對(duì)生長(zhǎng)量減少, 脅迫時(shí)間延長(zhǎng)受害加劇[21]。本研究表明, 堿脅迫對(duì)玉米植株傷害大于鹽脅迫, 這與前人研究結(jié)果一致[22]。原因可歸結(jié)為, 堿脅迫下pH值升高, 嚴(yán)重破壞細(xì)胞原生質(zhì)膜系統(tǒng)和光合結(jié)構(gòu), 使有氧呼吸及光合功能下降[23]。此外, pH值升高還可能使某些微量元素利用率降低, 如Fe、Mg等直接影響葉綠素合成[24], 光合色素含量降低[25], 作物生長(zhǎng)受限, 產(chǎn)量下降。

眾多研究報(bào)道指出, GP、PH、FW、DW、TWC、SKC、SNC、NKR、STR/ATR等指標(biāo)在作物耐鹽堿鑒定中具可行性[4,6-7,14,27]。這些指標(biāo)均具有可操作性強(qiáng)、周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn), 而且鑒定結(jié)果與全生育期鑒定結(jié)果極顯著相關(guān), 適宜大量材料的耐鹽堿性篩選[26]。耐鹽/堿率作為植物耐鹽堿性鑒定指標(biāo)中最直觀的指標(biāo)廣泛被使用[27-29], 本研究也將其作為重要指標(biāo)評(píng)價(jià)家系耐鹽堿性, 并用于QTL定位。

3.2 CIM、ICIM和MCIM對(duì)玉米苗期耐鹽堿相關(guān)性狀的加性QTL定位分析

基于多種QTL作圖方法對(duì)玉米耐鹽堿相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位, 與以往研究中采用的單一遺傳模型相比, 增強(qiáng)了QTL檢出率, 提高了QTL位置及效應(yīng)估計(jì)的精準(zhǔn)度。因此, 本研究認(rèn)為采用CIM、ICIM和MCIM 3種作圖方法共同發(fā)現(xiàn)的QTL可信度較高。比較發(fā)現(xiàn), CIM定位到的QTL基本覆蓋了ICIM及MCIM的定位結(jié)果, 且貢獻(xiàn)率也相對(duì)較高, ICIM定位結(jié)果次之, MCIM定位結(jié)果最少, 這與梁銀培等[30]的研究結(jié)果吻合。其原因可能是MCIM較ICIM除考慮加性、上位性互作外, 還包括與環(huán)境互作效應(yīng)[31]。當(dāng)然, QTL的作圖原理都是數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)中的概率事件, 盡管CIM檢測(cè)到的QTL數(shù)量較多, 但不能排除存在假陽(yáng)性的可能, 導(dǎo)致遺漏一些重要遺傳信息[32]。本研究檢測(cè)到的55、66和71個(gè)相關(guān)QTL中,與、與、與、與分別以鹽脅迫和堿脅迫作為環(huán)境因子被MCIM共同檢測(cè)到;、與,、與分別以堿脅迫與鹽脅迫作為環(huán)境因子被MCIM和CIM的鹽脅迫條件下共同檢測(cè)到;、與分別以堿脅迫和鹽脅迫作為環(huán)境因子被MCIM與ICIM的鹽脅迫條件下共同檢測(cè)到;、與被ICIM的鹽脅迫、堿脅迫與ICIM的鹽脅迫條件下共同檢測(cè)到。

大量的研究表明, 植物的耐鹽堿相關(guān)性狀表現(xiàn)為連續(xù)性變異, 是受多個(gè)基因共同調(diào)控的復(fù)雜數(shù)量性狀[33-35]。本研究以200 mmol L–1NaCl和100 mmol L–1Na2CO3溶液分別作為鹽、堿脅迫溶液, 二者Na+含量相同。上述性狀同時(shí)在鹽、堿脅迫條件下重復(fù)檢測(cè)到, 表明這些QTL可能是響應(yīng)Na+脅迫的QTL。鹽、堿脅迫條件下重復(fù)檢測(cè)到與表明, Na+、K+濃度的遺傳是互為獨(dú)立的。、、、、共區(qū)間,、、、、、、、共區(qū)間, 它們形成2個(gè)QTL簇, 表明這些性狀可能是由單基因或多個(gè)緊密連鎖基因共同調(diào)控的。

值得注意的是,、與,、與,、與同時(shí)被CIM、ICIM的鹽脅迫條件下和MCIM共同檢測(cè)到。、與同時(shí)被CIM、ICIM的堿脅迫條件下和MCIM共同檢測(cè)到。、、與、同時(shí)被CIM和ICIM在自然條件下、CIM的鹽脅迫條件下以及堿脅迫作為環(huán)境因子的MCIM共同檢測(cè)到。因此, 鹽脅迫下的、、、和堿脅迫下的、將為下一步精細(xì)定位耐鹽堿主效QTL, 進(jìn)而圖位克隆玉米耐鹽堿主效基因奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.3 與前人耐鹽堿性分析結(jié)果比較

與前人研究比較, 本研究結(jié)果盡管有部分QTL處于相鄰區(qū)域, 但大部分QTL結(jié)果處于不同區(qū)間, 這可能與作圖群體不同和鹽/堿兩種處理方式對(duì)玉米傷害作用機(jī)制不同有關(guān)。本研究將擬開展下步精細(xì)定位進(jìn)而圖位克隆的5個(gè)QTL、、、、, 與前人玉米耐鹽堿定位結(jié)果比較(表4, 附表1~附表3)表明,位于第3染色體, 區(qū)間為219.78~219.97 Mb, 與管飛翔[3]檢測(cè)到影響堿環(huán)境下相對(duì)胚根長(zhǎng)的定位在相鄰區(qū)域;位于第6染色體, 區(qū)間為163.71~165.05 Mb, 與吳丹丹[6]檢測(cè)到影響植株K+含量的和管飛翔[3]檢測(cè)到影響植株胚芽長(zhǎng)的定位在相鄰區(qū)域;位于第7染色體, 區(qū)間為169.88~172.62 Mb, 該QTL在前人的耐鹽堿定位中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道;位于第8染色體, 區(qū)間為26.59~106.74 Mb, 與Luo等[8]檢測(cè)到影響株高的定位到相同區(qū)間, 與管飛翔[3]檢測(cè)到影響植株胚芽長(zhǎng)的定位在相鄰區(qū)域;位于第9染色體, 區(qū)間為103.92~109.32 Mb, 與Luo等[8]檢測(cè)到影響株高系數(shù)的定位在相鄰區(qū)域。

3.4 作物耐鹽堿QTL定位存在問題與解決對(duì)策

3.4.1 表型鑒定滯后與高通量精準(zhǔn)表型鑒定平臺(tái)搭建 QTL定位有表型鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而, 由于難以模擬實(shí)際生境, 作物耐鹽堿性狀表型鑒定最容易出現(xiàn)偏差。相比迅猛發(fā)展的高通量基因型檢測(cè)技術(shù), 發(fā)展遲緩的精準(zhǔn)表型鑒定技術(shù)已成為制約數(shù)量性狀基因定位的主要瓶頸。為了有效地解決上述難題, 必須搭建可控環(huán)境下的高通量精準(zhǔn)表型鑒定平臺(tái)。它主要基于機(jī)器視覺技術(shù), 對(duì)單株植物近距離觀測(cè)分析其長(zhǎng)勢(shì)信息和表型參數(shù), 在自動(dòng)化流水線和智能圖像處理系統(tǒng)支持下, 開展大規(guī)模觀測(cè)與分析研究。

表4 前人耐鹽堿研究結(jié)果

Table 4 Reported salt-alkali tolerance QTLs in the study

性狀TraitQTL染色體Chr.左標(biāo)記Left marker右標(biāo)記Right marker位置Position (cM)LOD加性效應(yīng)Additive effect貢獻(xiàn)率R2 (%)參考文獻(xiàn)References SRLPqSRLP-11umc1568umc140355.302.49–0.077.50管飛翔[3] SRLRqSRLR-77umc2160phi0346.803.47–0.066.05Guan [3] ARLPqARLP-11phi120umc174434.222.58–0.094.75 SRLRqARLR-3-13umc1052umc205029.013.820.1110.20 SRLRqARLR-3-23dupssr17bnlg19748.012.25–0.063.96 LPqLP-1010umc1196umc204318.252.34–0.404.15 LRqLR-11umc1306phi12012.012.060.976.06 LRqLR-22umc2129umc21102.012.150.814.15 LRqLR-66umc1490umc176221.462.290.945.74 LRqLR-88umc1777umc2075135.332.310.844.48 FWqFW-11phi064phi2654528.833.58–0.56787王士磊等[4] DWqDW-11phi064phi2654528.833.13–0.52198Wang et al.[4] PHqPH-11phi064phi2654529.002.79–0.24787 DWqDW-55phi024umc169225.602.68–0.06838 STqST-55phi087phi04888.094.341.337610 STqST-66phi126phi423796.572.651.14716 FGRQFgr11PZE101140869PZE10113811677.1–12.22030.43吳丹丹[6] FSTRQFstr11PZE101140869PZE10113811677.10.78358.33Wu [6] STRQStr11PZE101130082PZE10111934285.90.22214.25 STRQStr33PZE103072593PZE10307241544.10.31824.98 STRQStr77PZE07012564PZB02215.492.9–0.1423.37 TWCQTwc11PZE101130082PZE10111934285.9–0.4891.65 TWCQTwc33PZE103083718SYN1651947.1–0.68211.65 TWCQTwc77PZE107020363SYN2418682.10.3642.41 TWCQTwc99PZA03596.1PZE10906199748.3–0.3844.19 SNCQSnc33PZE103052343PZE10307259343.7–0.9484.33 SNCQSnc55SYN22663PZE105006095119.7–0.8814.37 SKCQSkc33PZE103072593PZE10307241544.13.93615.43 SKCQSkc55SYN29254PZE10513711234.1–2.3288.22 SKCQSkc77PZE107104709PZE10710329435.6–1.6604.36 SKCQSkc99PZE109034705PZE10903792947.12.3075.43 SKNQSkn33PZE103072415PZE10307377044.117.3582.32 SKNQSkn4.14PZE104049567PZE10405217582.240.29416.81 SKNQSkn4.24PZE104033683PZE10403137484.432.66716.85 SKNQSkn55PZE105182641PZE1051778181.0016.1891.21 SKNQSkn66SYN9304SYN2298973.80–12.7951.17 NPH(2014)qNPH44PZE104023902SYN488949.714.398.408.33Luo等[8] NPH(2014)qNPH88PZE108041337-PZE10809011456.013.678.126.90Luo et al.[8] NPH(2015)qNPH44PZE104023902PZE10408153046.016.287.7810.11 NPH(2015)qNPH55PZE105045981PZE10512858173.513.195.554.98 NPH(2015)qNPH88PZE108028588PZE10810336561.615.036.947.07 NPH(2015)qNPH9-29PZE109064469SYN2720171.314.566.617.24 NPH(2016)qNPH88PZE108041337PZE10809744657.314.298.117.75 NPH(2016)qNPH9-19PZE109011840PZE10904051945.815.798.9310.74

(續(xù)表4)

性狀TraitQTL染色體Chr.左標(biāo)記Left marker右標(biāo)記Right marker位置Position (cM)LOD加性效應(yīng)Additive effect貢獻(xiàn)率R2 (%)參考文獻(xiàn)References NPH(mean)qNPH44PZE104023902PZE10408153049.716.978.1311.90 NPH(mean)qNPH88PZE108028588PZE10809011457.313.886.406.36 NPH(mean)qNPH9-29PZE109064469SYN2720171.314.806.667.97 SPH(2014)qSPH11SYN309SYN2592095.214.4713.7913.28 SPH(2015)qSPH11PZE101094436PZE10115051388.5111.4616.8616.99 SPH(2015)qSPH5-15SYN16675PZE10512858177.313.508.825.01 SPH(2016)qSPH11PZE101109084SYN2592090.2119.4724.6935.03 SPH(2016)qSPH5-25PZE105049283PZE10511775771.014.2619.866.17 SPH(mean)qSPH11PZE101094436PZE10115051388.5122.4019.1431.24 SPH(mean)qSPH5-15SYN1390PZE10512858177.313.326.553.96 PHI(2014)qPHI11PZE101109084SYN2592094.818.940.1028.10 PHI(2014)qPHI33SYN28626PZE10301916323.514.630.6713.64 PHI(2015)qPHI11SYN5444SYN2592090.2110.590.0819.51 PHI(2016)qPHI11PZE101109084SYN2592090.2114.270.0927.51 PHI(mean)qPHI11PZE101109084SYN2592090.2116.200.0725.94 PHI(mean)qPHI44SYN4889SYN425056.914.140.035.63 PHI(mean)qPHI99SYN24345SYN5732130.343.390.035.59 PHI(mean)qPHI1010PZE110100655SYN19213108.163.290.034.47 ATRqATR22phi402893umc22462.40–0.296.0馬曉軍等[5] ATRqATR5.15umc1894phi0242.10–0.101.1Ma et al.[5] ATRqATR5.25umc2306phi0872.40–0.248.6 ATRqATR77bnlg2132phi0573.70–0.217.0

SRLP: 鹽環(huán)境下相對(duì)胚芽長(zhǎng); SRLR: 鹽環(huán)境下相對(duì)胚根長(zhǎng); ARLP: 堿環(huán)境下相對(duì)胚芽長(zhǎng); LP: 胚芽長(zhǎng); LR: 胚根長(zhǎng); FW: 地上鮮重; DW: 地上干重; PH: 株高; ST: 存活時(shí)間; FGR: 鹽池種子萌發(fā)率; FSTR: 鹽池耐鹽指數(shù); STR: 耐鹽指數(shù); TWC: 組織含水量; SNC: 地上部分鈉離子含量; SKC: 地上部分鉀離子含量; SKN: 地上部分鉀鈉比; NPH: 對(duì)照株高; SPH: 鹽池株高; PHI: 株高耐鹽指數(shù); ATR: 耐堿率。

SRLP: salt environment relative length of plumule; SRLR: salt environment relative length of radicle; ARLP: alkali environment relative length of plumule; LP: length of plumule; LR: length of radicle; FW: shoot fresh weight; DW: shoot dry weight; PH: plant height; ST: survival time; FGR: field germination rate; FSTR: field salt tolerance rating; STR: salt tolerance rating; TWC: tissue water content; SNC: shoot Na+content; SKC: shoot K+content; SKN: shoot K+/Na+; NPH: plant height in control field; SPH: plant height in saline field; PHI: salt tole-rance index based on plant height; ATR: alkaline tolerance rating.

3.4.2 亟須挖掘微效QTL與全基因組測(cè)序 作物耐鹽堿性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀, 盡管通過圖位克隆的方法在主效QTL區(qū)段已挖掘到耐鹽堿基因, 但繼續(xù)在微效QTL區(qū)段開展圖位克隆則需要更大的工作量。隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)與儀器的發(fā)展, 測(cè)序成本大幅下降和測(cè)序速度不斷加快。目前, 玉米、水稻等10多種作物已完成全基因組測(cè)序, 一些跨國(guó)公司實(shí)現(xiàn)了基因型檢測(cè)從樣品制備到分子檢測(cè)的全自動(dòng)處理。隨著人們對(duì)植物基因組認(rèn)知的不斷深入, 植物功能基因組研究進(jìn)入了高通量分析的階段, 針對(duì)數(shù)量性狀的QTL定位和克隆得到了一系列的優(yōu)化[36]。

最新測(cè)序技術(shù)的逐步應(yīng)用, 依靠高通量測(cè)序儀, 揭示了許多作物全基因組測(cè)序結(jié)果, 對(duì)基因型鑒定起到革命性推動(dòng)作用。同時(shí), 高通量、全自動(dòng)的表型檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟, 構(gòu)建精準(zhǔn)表型鑒定平臺(tái), 提高表型鑒定的精度和效率。最終, 必然會(huì)縮短挖掘耐鹽堿等數(shù)量性狀的基因的時(shí)間, 并提高其準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

玉米對(duì)Na2CO3脅迫更加敏感且傷害更嚴(yán)重, 其對(duì)Na+、K+的吸收和運(yùn)輸是相互獨(dú)立的兩個(gè)過程, 玉米鹽、堿脅迫可能是兩種性質(zhì)不同的脅迫。在自然、鹽和堿脅迫條件下, 運(yùn)用CIM分別檢測(cè)到27、28、40個(gè)加性QTL; 運(yùn)用ICIM分別檢測(cè)到28、23、17個(gè)加性QTL; 運(yùn)用MCIM共檢測(cè)到11個(gè)耐鹽加性QTL、4個(gè)環(huán)境互作效應(yīng)QTL以及11個(gè)耐堿加性QTL、3個(gè)環(huán)境互作效應(yīng)QTL。鹽脅迫條件下的、、、和堿脅迫條件下的、能被3種作圖方法重復(fù)檢測(cè)到。與前人研究結(jié)果比較,、、、-3定位在相同或鄰近區(qū)域,尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果為精細(xì)定位玉米耐鹽堿主效基因、挖掘候選基因和開發(fā)用于標(biāo)記輔助選擇的實(shí)用功能標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

附表 請(qǐng)見網(wǎng)絡(luò)版: 1) 本刊網(wǎng)站http://zwxb.china-crops.org/; 2) 中國(guó)知網(wǎng)http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb. aspx。

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QTL mapping of salt and alkaline tolerance-related traits at the germination and seedling stage in maize (L.) using three analytical methods

ZHANG Chun-Xiao1, LI Shu-Fang1, JIN Feng-Xue1, LIU Wen-Ping1, LI Wan-Jun2, LIU Jie1,3, and LI Xiao-Hui1,*

1Crop Germplasm Resources Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling 136100, Jilin, China;2Taonan Research Center, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Taonan 137100, Jilin, China;3College of Agronomy, Yanbian University, Yanji 133400, Jilin, China

The recombinant inbred line (RIL) F2:5population was derived from a cross between Zheng 58 tolerant to alkaline stress and Chang 7-2 sensitive to alkaline stress. By using the 3K chips, the high-density genetic map with 1407 SNP markers was constructed. The number of markers on 10 chromosomes ranged from 84 to 191, and the average physical distance between two markers was 0.81 cM. The germination percentage (GP), plant height (PH), fresh weight (FW), dry weight (DW), tissue water content (TWC), shoot Na+concentration (SNC), shoot K+concentration (SKC), shoot K+/Na+ratio (NKR), salt tolerance rating (STR), or alkaline tolerance rating (ATR) were measured under 200 mmol L–1NaCl solution of salt stress, 100 mmol L–1Na2CO3solution of alkaline stress and the normal water or full-strength Hoagland’s nutrient solutions irrigation as control conditions. The additive quantitative trait loci (QTLs) analysis was conducted by using the composite interval mapping (CIM) and the complete interval mapping method (ICIM), the additive and epistatic QTL × environment interaction effects were analyzed by using the mixed composite interval mapping method (MCIM). Compared with the normal condition, the alkaline stress decreased the tole-rance more significantly than the salt stress. Maize was more sensitive to the alkaline stress. The harm of alkaline stress on maize was more serious. The SKC was comparable, but the SNC had great difference for alkaline and salt stresses indicating that the uptake and transport of Na+and K+were independent and salt and alkali were two different kinds of stresses. Under normal condition, salt stress and alkaline stress, 27, 28, and 40 additive QTLs were respectively detected by CIM, and 28, 13, and 17 additive QTLs were respectively detected by ICIM. By using MCIM, a total of 11 additive QTLs and 4 QTL × environment interaction QTLs for salt tolerance-related traits, as well as a total of 11 additive QTLs and 3 QTL × environment interaction QTLs for alkaline tolerance-related traits were detected. The QTLs,,,for salt tolerance and,for alkaline tolerance were repeatedly detected by three mapping methods. After comparing the physical positions of these QTLs with those previously reported, we found,,, andwere located in the same or adjacent position, butwas newly reported. The present study provides a good basis for mapping major genes, mining candidate genes and developing practically functional markers applied in the improvement of salt and alkaline tolerance-related traits in maize.

maize (L.); germination stage; seedling stage; salt/alkaline tolerance; QTL mapping

2018-08-17;

2019-01-12;

2019-02-01.

10.3724/SP.J.1006.2019.83060

李曉輝, E-mail: lixiaohui2002lix@163.com

E-mail: chunxiao1000@126.com

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0100103)和吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2017JC001, CXGC2017TD001)資助。

This study was supported by the National Key R&D Program of China (2016YFD0100103) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Jilin Academy of Agricultural Sciences (CXGC2017JC001, CXGC2017TD001).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190201.0918.002.html