李群秀，付鳳林，張勝利

0 引言

膀胱癌（bladder cancer）是泌尿腫瘤系常見的惡性腫瘤，近90%的膀胱癌患者屬于移行細(xì)胞癌。盡管患者可進(jìn)行相應(yīng)的手術(shù)治療，但因其具有侵襲、轉(zhuǎn)移的特性，使患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，造成患者預(yù)后困難，因此探索膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)分子生物學(xué)特性，有助于更好地對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估和個(gè)體化治療[1]。腫瘤細(xì)胞黏附是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]，因此研究腫瘤細(xì)胞黏附有助于研究腫瘤預(yù)后。整合素β1（Integrinβ1）是整合素（Integrins）家族成員，具有介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、分化等生物學(xué)行為。目前Integrinβ1已被報(bào)道在結(jié)直腸癌[3]、食管鱗癌[4]、乳腺癌[5]等多種腫瘤中過度表達(dá)。含半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白3（CARD recruited membrane associated protein 3, CARMA-3）主要參與G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）或表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）誘導(dǎo)的NF-κB異?；罨倪^程。NF-κB異?；罨c炎性反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-8]。研究還發(fā)現(xiàn)，CARMA-3在多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)[8-9]，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與浸潤[10]，并且與腫瘤生長、分期相關(guān)[11]。但關(guān)于Integrinβ1及CARMA-3表達(dá)與膀胱癌經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后預(yù)后關(guān)系的系統(tǒng)性研究報(bào)道甚少。本研究檢測(cè)膀胱癌組織中Integrinβ1及CARMA-3蛋白的表達(dá)情況，并探討其與經(jīng)膀胱癌電切術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2013年12月我院收治的160例經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)治療的膀胱癌患者，保留患者的癌旁組織（距膀胱癌邊緣3 cm）和膀胱癌組織標(biāo)本，并對(duì)患者隨訪5年。其中，20例失訪，10例死于其他疾病，2例中途退出，20例無復(fù)發(fā)，共納入108例復(fù)發(fā)患者。根據(jù)患者尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間分為短期復(fù)發(fā)組50例（6月內(nèi)復(fù)發(fā)的患者）和長期首次復(fù)發(fā)組58例（3年以上第一次復(fù)發(fā)的患者）。本研究經(jīng)患者知情同意，并通過了倫理委員會(huì)的認(rèn)定（編號(hào)：201112A03）。

1.2 方法

將納入患者的膀胱癌組織和癌旁組織的石蠟標(biāo)本，制作5 μm厚度的石蠟切片。參照免疫組織化學(xué)試劑盒（購自深圳寶安康生物公司）說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)步驟如下：常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)液（0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液）98℃修復(fù)20 min，室溫下3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min，水洗2次，晾干；山羊血清封閉30 min；甩除封閉液，加入Integrinβ1單克隆抗體（1:100稀釋; Cat: sc-9970; Santa Cruz; 美國）或CARMA-3單克隆抗體（1:100稀釋; Cat:SAB4501342; Sigma; 美國），4℃孵育過夜，PBS洗2次，孵育相應(yīng)二抗室溫孵育40 min，PBS洗2次；DAB顯色3 min，Mayer's蘇木精對(duì)比染色細(xì)胞核，1%鹽酸酒精分化3秒，水洗2次，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

Integrinβ1及CARMA-3進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜變?yōu)樽厣暈殛栃?。Integrinβ1及CARMA-3都依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)比例和染色強(qiáng)度參考相關(guān)半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（1）依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例區(qū)分：沒有陽性細(xì)胞記為0分；陽性細(xì)胞所占比例＜30%記為1分；陽性細(xì)胞≥30%記為2分。（2）依據(jù)著色情況區(qū)分：沒有著色記為0分；表現(xiàn)為淡黃色記為1分；表現(xiàn)為棕黃色記為2分；表現(xiàn)為棕褐色記為3分。計(jì)算以上所得評(píng)分的乘積，若為0分，則為陰性；若為1～2分，則為弱陽性；若為3～4分，則為中陽性；若為5～6分，則為強(qiáng)陽性。閱片的積分是由病理科兩名高年資同事對(duì)評(píng)分一致的切片直接通過；評(píng)分不一致的切片商討通過；商討不一致的切片經(jīng)第三人判定通過。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料分析

兩組患者在年齡和性別上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在T分期和病理分級(jí)上比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；短期復(fù)發(fā)組T1期和T2期所占比例大于長期首次復(fù)發(fā)組；且低分化所占比例大于長期首次復(fù)發(fā)組，見表1。

表1 短期復(fù)發(fā)組和長期首次復(fù)發(fā)組患者的一般資料比較 (n(%))Table1 Comparison of general clinical data between short-term recurrence group and long-term first recurrence group (n(%))

2.2 Integrinβ1和CARMA-3蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況

兩組膀胱癌組織中Integrinβ1和CARMA-3蛋白均位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜，見圖1，其中短期復(fù)發(fā)組患者的Integrinβ1和CARMA-3蛋白表達(dá)顯著高于長期復(fù)發(fā)組（P＜0.05），見表2。

圖1 短期復(fù)發(fā)組和長期首次復(fù)發(fā)組CARMA-3和Integrinβ1蛋白的表達(dá) (IHC ×200)Figure1 Integrinβ1 and CARMA-3 expressions in shortterm recurrence group and long-term first recurrence group (IHC ×200)

表2 短期復(fù)發(fā)組和長期首次復(fù)發(fā)組中Integrin β1和CARMA-3蛋白表達(dá) (n(%))Table2 Expressions of Integrin β1 and CARMA-3 in short-term recurrence group and long-term first recurrence group (n(%))

圖2 不同T分期膀胱癌組織中CARMA-3和Integrinβ1蛋白的表達(dá)(IHC ×200)Figure2 Integrinβ1 and CARMA-3 expressions in different T stages of bladder cancer (IHC ×200)

2.3 Integrinβ1、CARMA-3蛋白表達(dá)和患者臨床病理特征的關(guān)系

不同T分期Integrinβ1和CARMA-3蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)結(jié)果，見圖2；Integrinβ1、CARMA-3蛋白的表達(dá)與T分期和分級(jí)成正相關(guān)，即：分期以及分級(jí)越高，患者的Integrinβ1蛋白和CARMA-3陽性表達(dá)越高（P＜0.05），見表3。

2.4 Integrinβ1和CARMA-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Integrinβ1和CARMA-3兩種蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（r=0.774,P＜0.001），見表4。

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖腫瘤中常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，且呈明顯上升趨勢(shì)[12]。膀胱癌根據(jù)其臨床特征大致分為表淺性膀胱癌、肌層浸潤性膀胱癌和轉(zhuǎn)移性膀胱癌。表淺性膀胱癌是較早期的膀胱癌，首選經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)治療，該手術(shù)創(chuàng)傷小、恢復(fù)快。但目前為止，關(guān)于尿道腫瘤電切術(shù)后膀胱癌復(fù)發(fā)和預(yù)后方面的研究尚不全面。

研究表明，腫瘤的復(fù)發(fā)是一個(gè)多因素共同參與的復(fù)雜過程，而腫瘤細(xì)胞黏附是參與這個(gè)過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[2]。Vallo等[13]發(fā)現(xiàn)，抑制Integrinβ1表達(dá)能抑制尿路上皮腫瘤細(xì)胞（包含膀胱癌細(xì)胞）黏附。Integrinβ1高表達(dá)與胰腺癌[14]、結(jié)直腸癌[15]、乳腺癌[16]等多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)Integrinβ1蛋白在經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后短期復(fù)發(fā)組明顯高于遠(yuǎn)期首次復(fù)發(fā)組（P＜0.05），且Integrinβ1的表達(dá)與膀胱癌的T分期和分級(jí)明顯相關(guān)（P＜0.05），結(jié)果暗示Integrinβ1蛋白是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后膀胱癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因子。

而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移一般伴隨著G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor, GPCR）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）異常表達(dá)和失調(diào)[17]。CARMA-3主要參與GPCR及EGFR誘導(dǎo)的NF-κB激活腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過程[6-8]。且眾多研究表明CARMA-3在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可導(dǎo)致腫瘤的不良預(yù)后[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)CARMA-3蛋白在經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后短期復(fù)發(fā)組明顯高于遠(yuǎn)期首次復(fù)發(fā)組（P＜0.05）且與膀胱癌的T分期和分級(jí)明顯相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步分析膀胱癌中Integrinβ1和CARMA-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.774,P＜0.05），提示Integrinβ1和CARMA-3在經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后膀胱癌的復(fù)發(fā)中可能具有協(xié)同作用，但是兩者參與調(diào)控腫瘤復(fù)發(fā)的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，表明Integrinβ1及CARMA-3表達(dá)與經(jīng)膀胱癌經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，由此推測(cè)Integrinβ1和CARMA-3可作為新的衡量經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后膀胱癌復(fù)發(fā)的分子標(biāo)志物。

表4 膀胱癌組織Integrinβ1和CARMA-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table4 Correlation of Integrinβ1 with CARMA-3 expression in bladder cancer tissues