朱青山，李軍擴，劉維鵬，馬庭煒，代寧濤，馮連杰，魏濤，周福有

0 引言

中國北部處于被稱為“食管癌地帶”的食管癌高發(fā)區(qū)[1]。尤其晉冀豫交界區(qū)，比世界低發(fā)區(qū)的發(fā)病率高出近60倍，食管癌仍居該地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病的首位[2]。放射治療是食管癌非手術(shù)治療的主要手段[3]。晚期不能手術(shù)的食管癌常規(guī)單純放療的5年生存率為10%左右。近年來雖然放療手段和放療技術(shù)取得巨大進步，但食管癌放療的總體生存率仍然沒有顯著提高[4]。臨床中經(jīng)常見到臨床分期相近的食管癌患者放療后療效存在明顯差異，這可能由于其基因突變譜的差異，使得相同病理類型的腫瘤具有不同的臨床表型，同時對放療的療效存在顯著差異[5]。研究顯示放射抵抗是腫瘤局部復(fù)發(fā)、放療失敗的重要原因，各種信號通路在食管癌放射抵抗形成中起到重要作用[6]。如果能在治療前發(fā)現(xiàn)放射抵抗的基因類型，從而預(yù)測出放療效果不佳的患者，逆轉(zhuǎn)放射抵抗，將能進一步提高生存率?；蛐酒夹g(shù)可以一次性對樣品大量基因序列進行檢測和分析，本研究即應(yīng)用基因芯片進行全基因組CNV分析，篩查食管癌放射抵抗相關(guān)基因，為選擇合理的治療方案提供有力的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年12月—2016年8月在安陽市腫瘤醫(yī)院行放射治療的食管癌患者66例，經(jīng)內(nèi)鏡活檢證實，病理類型均為鱗狀細胞癌，臨床資料完整，男女不限，年齡不限，放射治療均采取三維適形調(diào)強（IMRT）放療技術(shù)。根據(jù)臨床療效分為兩組，放射敏感組：放射治療后達到臨床完全緩解并且持續(xù)一年以上（以下稱S組）；放射抗拒組：放射治療未控，指放療無效或放療后半年內(nèi)放射野內(nèi)局部病變進展（以下稱R組）。每組各33例。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因芯片CNV檢測 利用Affymetrix公司的OncoScan Array全基因組芯片檢測全基因組SNP及拷貝數(shù)變異（copy number variation, CNV）。以提取自福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE）樣品的基因組 80 ng DNA為起始，采用分子倒置探針（molecular inversion probe, MIP）技術(shù)。比較基因組雜交（comparative genomic hybridization, CGH）實驗檢測熒光標記。主要包括如下步驟：（1）從FFPE組織切片中提取基因組DNA、純化和電泳質(zhì)控，用Qubit方法定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度。平均絕對百分偏差（MAPD）大于0.3的樣品認為不合格；（2） FFPE 樣品的基因組 80 ng DNA為起始，待檢測DNA采用分子倒置探針技術(shù)在液相中進行雜交、連接、第一次酶切、擴增和第二次酶切反應(yīng)。分子倒置探針由7部分序列組成：2個內(nèi)切酶識別位點，可用限制性內(nèi)切酶切割，2段與目的基因互補的序列、2段通用引物序列以及 1 段特異性標簽序列；（3）酶切后DNA進行生物素標記；（4）標記DNA的特異性標簽序列與芯片雜交；（5）芯片雜交、清洗、染色，染色完成后，將芯片放到掃描儀（GeneChip? Scanner 3000）掃描。

1.2.2 數(shù)據(jù)提取和分析 當完成雜交和熒光標記后，芯片的熒光掃描圖像被保存成DAT文件，AGCC軟件（Affymetrix? GeneChip?Command Console? Software）將DAT文件從圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號即CEL文件。CEL文件記錄探針水平的熒光信號強度值信息。OncoScan Console軟件將CEL文件的AT/GC兩通道合并，轉(zhuǎn)換成OSCHP文件，進行數(shù)據(jù)提取?；贠SCHP文件，使用Nexus Express for OncoScan 3軟件進行CNV和體細胞突變分析，采用TuScan算法。將獲得的生物學(xué)信息與參考基因組進行覆蓋度的統(tǒng)計分析。檢測得到的變異結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫、DBSNP數(shù)據(jù)庫、外顯子組測序計劃數(shù)據(jù)庫進行比對、分析。挑選出兩組的基因拷貝數(shù)差異及代表性基因。

1.2.3 驗證分析 挑選出CNV差異顯著的片段，應(yīng)用Thermo Fisher 7500 qPCR儀對篩選出的CNV片段內(nèi)的代表基因進行實時熒光定量PCR進行驗證。進行DNA抽提、擴增，擴增階段進行40個循環(huán)，采取相對定量的2-ΔΔCt方法進行基因表達分析。進一步篩選出可能的目標基因。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，兩獨立樣本資料的比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗。計量資料用（±s）表示，組間均數(shù)比較使用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 樣本質(zhì)量評價

利用Affymetrix平臺提取FFPE樣品的基因組DNA，然后用Qubit方法定量，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度。先進行20例DNA測序樣品電泳，13份質(zhì)檢合格，為兩組配比平衡，每組病例各挑選5例樣本，共10例進行下一步基因芯片分析。納入檢測的10例樣本的臨床特征，見表1。食管癌的病變部位分段方法結(jié)合食管鋇餐、胃鏡和CT檢查，分段標準按UICC 1997公布的分段標準[7]。

表1 放射敏感組（S組）和放射抗拒組（R組）患者的一般臨床資料（例）Table1 Clinical data of radiosensitive (S) and radioresistant (R) groups (n)

2.2 芯片分析結(jié)果

對基因芯片檢測的全基因組拷貝數(shù)變異（CNV）數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，見圖1～2?？紤]樣品數(shù)目較少，兩組CNV差異比較的P值參考意義不大，我們挑選出兩組間CNV發(fā)生頻率之差≥40%，并且與已知CNV沒有重疊的 CNV片段做為本研究初步結(jié)果。共發(fā)現(xiàn)5個有意義 CNV片段，分別位于3、4、8、11、17號染色體，其中拷貝數(shù)缺失的（CN Loss）3個，增加的（CN Gain）1個，雜合性缺失的（LOH）1個。3p12.3 拷貝數(shù)缺失與17q11.2 LOH在放射抵抗組（R組）的發(fā)生頻率高于放射敏感組（S組），4p16.3、 11q23.3拷貝數(shù)缺失和8q23.3拷貝數(shù)增加在S組的發(fā)生頻率高于R組，見表2。

2.3 qPCR驗證結(jié)果

在5個CNV差異有意義的片段內(nèi)，通過UCSC數(shù)據(jù)庫分別挑選出5個可能的代表性基因，進行qPCR驗證實驗。5個代表性基因分別為ROBO1、NSD2、CSMD3、CADM1、NF1。在S組和R組每組中各選取11例，共22例PPFE標本。選取白蛋白（ALB）為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物序列為：F: ATGCTGCACAGAATCCTTGGT；R: TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA。內(nèi)參基因和待測基因擴增曲線平滑，溶解曲線單一，實驗數(shù)據(jù)真實可信，可用于后期分析。擴增及溶解曲線見圖3～8。

圖2 10例食管癌樣本中拷貝數(shù)變異（CNV）的染色體G帶圖Figure2 Ideogram of CNV in Chromosome G band in 10 cases of ESCC samples

表2 放射敏感組（S組）和放射抵抗組（R組）患者的芯片分析結(jié)果Table2 Gene chip analysis results of radiosensitive (S) and radioresistant (R) groups

圖3 內(nèi)參基因擴增曲線及溶解曲線Figure3 Amplification and dissolution curves of reference genes

采用2-ΔΔCt作為評價基因水平的指標，結(jié)果顯示基因ROBO1、NF1在兩組中的拷貝數(shù)無明顯差別。CSMD3雖然在S組中的拷貝數(shù)高于R組，但兩組表達均較低，沒有臨床意義。NSD2在R組中的拷貝數(shù)明顯高于S組。CADM1在兩組中的P值沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但是絕對值相差比較大，可能有一定意義，見表3。

圖4 ROBO1基因擴增曲線及溶解曲線Figure 4 Amplification and dissolution curves of ROBO1 gene

圖5 NSD2基因擴增曲線及溶解曲線Figure5 Amplification and dissolution curves of NSD2 gene

3 討論

世界范圍內(nèi)，食管癌占癌癥死亡的第六位[8]?？傮w來講，食管癌預(yù)后遠端好于近端。鱗癌比腺癌生存期要差[9]。我國食管癌人群中90%以上為食管鱗癌[10]。放射治療為非手術(shù)治療食管癌患者的根治性治療手段，但是與手術(shù)治療不同，頸段、胸上段食管癌患者放療后生存優(yōu)于胸中、下段食管癌患者[11]。

腫瘤放療敏感度是一個復(fù)雜而極具個體化的問題。目前尚未得到量化指標可準確判斷食管癌患者對放療或放化療的敏感度。基因芯片具有高通量、高效率和高自動化、高敏感度等優(yōu)點，成為分析基因表達模式的一種高效方法。OncoScanTM芯片采用分子倒置探針MIP技術(shù)，能夠?qū)FPE樣本進行檢測，顯著提高了分辨率。

圖6 CSMD3基因擴增曲線及溶解曲線Figure6 Amplification and dissolution curves of CSMD3 gene

圖7 CADM1基因擴增曲線及溶解曲線Figure7 Amplification and dissolution curves of CADM1 gene

圖8 NF1基因擴增曲線及溶解曲線Figure8 Amplification and dissolution curves of NF1 gen

表3 5個篩選基因的qPCR結(jié)果 (±s,n=10)Table3 qPCR results of five genes (±s, n=10)

表3 5個篩選基因的qPCR結(jié)果 (±s,n=10)Table3 qPCR results of five genes (±s, n=10)

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本研究采用基因芯片初步探討了與食管癌放療敏感度相關(guān)的分子事件，篩選出可能對食管癌放射敏感度預(yù)測價值最大的5個基因拷貝數(shù)變異（CNV）區(qū)域，并針對這5個區(qū)域內(nèi)的代表性基因進行qPCR驗證。發(fā)現(xiàn)4p16.39（代表性基因NSD2）和11q23.3（代表性基因CADM1）的拷貝數(shù)缺失（Loss）發(fā)生率在放射抵抗組（R組）中明顯高于放射敏感組（S組）。我們認為NSD2和CADM1可能是與食管癌放射抵抗的相關(guān)位點，其機制有待更多的研究進一步驗證。

NSD2位于染色體4p16.3上，主要功能是參與組蛋白的甲基化修飾。沉默NSD2會導(dǎo)致細胞對DNA損傷劑如羥基脲，喜樹堿和絲裂霉素C以及電離輻射的敏感度增加。NSD2調(diào)節(jié)DNA修復(fù)基因的表達[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)在放療抗拒組中有高水平的NSD2表達，與文獻報道的一致。進一步研究NSD2甲基轉(zhuǎn)移酶類的藥物開發(fā)，將有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤的放射抵抗。

CADM1稱細胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1, CADM1），研究報道的免疫組織化學(xué)的檢測結(jié)果顯示，與ESCC組織相比，CADM1 mRNA表達在正常組織中高度上調(diào)，表明CADM1表達的喪失影響ESCC的發(fā)病機制，侵襲和轉(zhuǎn)移以及預(yù)后[15-16]。其詳細機制需進一步研究。

這些研究結(jié)果提示食管癌對放射線產(chǎn)生放射抵抗是復(fù)雜的多基因共同作用的結(jié)果，以上2個基因涉及DNA損傷修復(fù)和細胞黏附等與治療敏感度相關(guān)的重要分子生物學(xué)通路。只有通過對基因表觀遺傳的全面分析才有可能全面解釋食管癌復(fù)雜的放射抵抗機制，為提高食管癌放射治療的敏感度提供新的靶點及策略。

本研究中樣本例數(shù)相對較少，統(tǒng)計學(xué)上篩選兩組差異基因存在假陽性率大的缺點。同時本研究兩組的臨床特征并不完全相同，是因為本研究是根據(jù)臨床無進展生存期的長短選擇的病例，臨床分期和病變分段沒有嚴格限制，也可能會造成結(jié)果的偏倚。下一步一方面需要擴大樣本量進行分層深入研究，另一方面需要進一步進行免疫組織化學(xué)驗證蛋白層面的表達。