陳曉靜，王薇，周琛斐，魏文斐，吳湘光，嚴(yán)瑞明，張延梅，梁羅嬌，吳砂，梁莉，鐘梅，余艷紅

0 引言

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的微生態(tài)系統(tǒng)，其獨(dú)特的生物學(xué)特性對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)具有重要作用[1-2]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages, TAMs）在腫瘤間質(zhì)中高度浸潤(rùn)，是TME中的重要炎性細(xì)胞，與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。巨噬細(xì)胞在局部微環(huán)境的作用下獲得其獨(dú)特表型特征，根據(jù)其表型不同可分為殺傷腫瘤的經(jīng)典激活型巨噬細(xì)胞（M1）和促進(jìn)腫瘤的替代激活型巨噬細(xì)胞（M2）[5]。M2型TAMs可通過(guò)上調(diào)腫瘤細(xì)胞促癌基因的表達(dá)，增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移能力[6]。本研究觀察了M2型TAMs在宮頸癌進(jìn)程中的分布情況，探索了M2型TAMs對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能機(jī)制，為抑制TME促宮頸癌侵襲遷移提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 95例宮頸組織蠟塊樣本均來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科的組織樣本庫(kù)（2011—2013年），包含正常宮頸組織16例、宮頸上皮內(nèi)瘤變41例（19例CINⅠ、22例CINⅡ～Ⅲ）和宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌38例。

1.1.2 細(xì)胞系 人宮頸癌細(xì)胞系SiHa和C33a、人單核巨噬細(xì)胞系THP1均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），胎牛血清FBS（四季青，浙江天杭生物科技有限公司），抗CD163抗體（北京中杉金橋公司），抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體、抗Vimentin抗體、抗MMP-9抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），SP二步法試劑盒（北京中杉金橋公司），MMP-9引物合成（上海英濰捷基生物公司），超敏ECL發(fā)光液（北京Biosharp公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 組織芯片經(jīng)枸櫞酸鈉修復(fù)液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)（高壓修復(fù)，5 min），抗CD163抗體（濃度1∶800）4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色液反應(yīng)2 min。

1.2.2 Western blot檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白變性處理后，蛋白上樣量25 μg，用8%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離。一抗（E-cadherin 1:1 000; N-cadherin 1:1 000; Vimentin 1:1 000; MMP-9 1:500）4℃孵育過(guò)夜，二抗（濃度1:5 000）室溫孵育1 h，超敏ECL發(fā)光液顯色并拍照。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè) 提取總RNA，取2.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR擴(kuò)增條件如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán)。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞形成單層后，采用10 μl Tip滴頭在培養(yǎng)板呈直線形劃痕單層細(xì)胞，劃痕形成后采用磷酸鹽緩沖液 （PBS）沖洗2次，并記錄不同時(shí)間段（0 h、48 h）劃痕區(qū)域細(xì)胞的遷移情況。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞消化，用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM重懸細(xì)胞，Transwell上室鋪有Matrigel膠并加入1×105個(gè)細(xì)胞，下室加800 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，8 h后取出小室，棉簽擦凈上室面的Matrigel膠及未穿透的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，流水洗滌5 min，正置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件，組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAMs浸潤(rùn)數(shù)目與宮頸病變程度呈正相關(guān)

利用不同病變程度的宮頸組織病理切片，以CD163標(biāo)記M2型TAMs，結(jié)果顯示CD163主要表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)，其浸潤(rùn)程度隨宮頸病變的進(jìn)展而增加，見(jiàn)圖1；進(jìn)一步分析CD163的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸病變臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CD163+TAMs在宮頸癌組織中的表達(dá)與FIGO分期（P=0.012）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.009）呈正相關(guān)，但與患者年齡、組織分化程度無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。以上結(jié)果提示CD163+TAMs與宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展密切相關(guān)。

2.2 TAMs促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移

懸浮的人THP1單核細(xì)胞用佛波酯（PMA）處理后，增殖停止并貼壁，被誘導(dǎo)為未分化的巨噬細(xì)胞M0；再加入IL4和IL13，活化為M2型TAMs，CD163表達(dá)明顯增高，見(jiàn)圖2，用于后續(xù)研究。

實(shí)驗(yàn)分為Blank、THP1-上清液（conditioned media, CM）和TAMs-CM刺激組。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，TAMs-CM刺激后，宮頸癌細(xì)胞系SiHa和C33a形態(tài)發(fā)生顯著改變，見(jiàn)圖3。Blank和THP1-CM刺激組細(xì)胞為“立方形、邊緣圓鈍”的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間融合度高；TAMs-CM刺激宮頸癌細(xì)胞系SiHa和C33a呈現(xiàn)瘦長(zhǎng)的間質(zhì)細(xì)胞樣改變，表現(xiàn)為“長(zhǎng)梭形、偽足伸長(zhǎng)、甚至出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞遷移，細(xì)胞間融合度降低”。

圖1 CD163在宮頸病變中的表達(dá)情況 (×200)Figure1 Expression of CD163 in cervical lesions (×200)

表1 CD163與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析Table1 Correlation of CD163 expression with clinicopathologic features of cervical cancer patients

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TAMs-CM刺激后，宮頸癌細(xì)胞系SiHa和C33a遷移能力較Blank、THP1-CM刺激組顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023,P=0.015），見(jiàn)圖4A。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TAMs-CM刺激后，宮頸癌細(xì)胞系SiHa和C33a的穿膜細(xì)胞數(shù)較Blank和THP1-CM刺激組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007,P=0.010），見(jiàn)圖4B，表明TAMs可顯著增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的體外侵襲能力。

2.3 TAMs誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）

Western blot結(jié)果顯示，與Blank和THP1-CM刺激組相比，TAMs-CM組SiHa和C33a細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin的表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-Cadherin和Vimentin的表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖5，提示TAMs可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

2.4 TAMs對(duì)宮頸癌細(xì)胞系MMP-9的表達(dá)調(diào)控作用

利用Western blot及RT-qPCR分別檢測(cè)不同條件巨噬細(xì)胞對(duì)宮頸癌細(xì)胞系SiHa和C33a的MMP-9蛋白和RNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果提示TAMs-CM作用于SiHa和C33a宮頸癌細(xì)胞系后，MMP-9顯著上調(diào)，與對(duì)照組THP1-CM相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6A。RNA水平的檢測(cè)也得到一致的結(jié)果，見(jiàn)圖6B。提示TAMs促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性變可能是通過(guò)上調(diào)MMP-9的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測(cè)不同激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞CD163的表達(dá)Figure2 Immunocytochemistry(ICC) detection of CD163 expression in macrophages with different activation states

圖3 Blank、THP1-CM和TAMs-CM刺激組中SiHa和C33a細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變Figure3 Morphological changes of SiHa and C33a cells in Blank, THP1-CM and TAMs-CM stimulation groups

圖4 劃痕(A)及Transwell(B)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAMs對(duì)宮頸癌細(xì)胞株SiHa遷移和侵襲行為的影響Figure4 Effect of TAMs on migration and invasion of cervical cancer SiHa cell lines detected by scratch(A) and Transwell(B) assays

圖5 TAMs對(duì)宮頸癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響Figure5 Effect of TAMs on EMT of cervical cancer cell lines

3 討論

炎性反應(yīng)微環(huán)境在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞的主要成分。研究表明，TAMs與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在直接關(guān)系[3,6-7]。本研究結(jié)果提示，組織中CD163+TAMs浸潤(rùn)程度隨著宮頸癌變病程進(jìn)展而明顯增高，并與宮頸癌FIGO分期及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈明顯正相關(guān)，提示TAMs浸潤(rùn)增多及其伴隨的炎性反應(yīng)微環(huán)境加重可能參與宮頸癌病變的發(fā)生發(fā)展。可見(jiàn)，M2型TAMs在腫瘤組織中的募集提示宮頸癌的不良預(yù)后。因此，研究TAMs影響宮頸癌細(xì)胞的作用機(jī)制并作出針對(duì)性干預(yù)對(duì)于指導(dǎo)宮頸癌臨床預(yù)后具有重要意義。

圖6 Western blot(A)和RT-qPCR(B)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TAMs對(duì)宮頸癌細(xì)胞系MMP-9表達(dá)的影響Figure6 Effect of TAMs on MMP-9 expression in cervical cancer cell lines detected by Western blot(A) and RT-qPCR(B) assays

局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，其中EMT在該過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是惡性腫瘤獲得侵襲表型的重要步驟，并成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[8-10]。研究表明，TAMs可分泌多種EMT相關(guān)細(xì)胞因子如TGF-β、CCL18、EGF等[11-12]。在口腔鱗癌中，TAMs可通過(guò)激活Gas6/Axl-NF-kB通路發(fā)揮促腫瘤作用并介導(dǎo)EMT的發(fā)生[13]。TAMs還能通過(guò)TGF-β和β-catenin通路介導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。本研究中，TAMs-CM刺激的宮頸癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，胞體由“立方形、邊緣圓鈍”的形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，偽足不同程度增多且變得細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞融合度降低，甚至出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞遷移，失去上皮細(xì)胞特性，顯示更多的間質(zhì)細(xì)胞樣特性，提示發(fā)生了一定程度的EMT。我們通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TAMs-CM刺激組的長(zhǎng)梭形宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移顯著增強(qiáng)，而且發(fā)生EMT表型變化，提示宮頸癌細(xì)胞發(fā)生形變后，細(xì)胞間黏附變差，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。由此我們推測(cè)TAMs可改變宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，在宮頸癌進(jìn)展中起著重要作用。

MMPs是一類高度保守的Zn2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶家族，在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成過(guò)程中起重要作用[15]。MMP-9是MMPs家族最重要的成員，在癌細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解中起關(guān)鍵作用，可破壞基底膜從而促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[16]。MMP-9在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，與不良預(yù)后密切相關(guān)[17-19]。有研究認(rèn)為，MMP-9的表達(dá)是宮頸癌發(fā)生的早期事件[20-21]。另外，MMP-9在機(jī)體免疫調(diào)控中亦扮演重要角色。有研究證實(shí)MMP-9加強(qiáng)腫瘤免疫逃逸進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)MMP-9的腫瘤細(xì)胞惡性程度更高[23]，與我們的研究結(jié)果相吻合。腫瘤細(xì)胞招募TAMs造成炎性反應(yīng)微環(huán)境，而招募的巨噬細(xì)胞又可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，形成惡性循環(huán)[24]。TAMs-CM刺激后的宮頸癌細(xì)胞高表達(dá)MMP-9，且侵襲遷移能力顯著增強(qiáng)，進(jìn)一步提示MMP-9可能作為中樞環(huán)節(jié)參與TAMs與腫瘤細(xì)胞之間的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，我們提出一個(gè)新的宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制：TME中TAMs上調(diào)宮頸癌細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。靶向TME中TAMs及MMP-9的治療，將為宮頸癌的治療和預(yù)后提供新的指導(dǎo)依據(jù)與干預(yù)視角。