徐單單，陳素紅，王穎

0 引言

食管癌是世界第六大致死性腫瘤疾病[1]。食管癌的治療主要采用手術(shù)治療與化療的方式，但效果仍不理想。

腫瘤干細胞是一小部分具有自我更新能力的細胞，它具有啟動形成腫瘤組織的特性[2]，受到胞內(nèi)外多種因素調(diào)控。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）在調(diào)控腫瘤細胞、腫瘤干細胞的增殖、存活、凋亡、耐藥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3]。已有研究表明STAT3對腫瘤干細胞這些性質(zhì)與功能是不可或缺的[4]。STAT3屬于STATs家族中的重要一員，STAT3調(diào)控細胞的生理過程，包括發(fā)育、生化、免疫以及代謝等重要生命活動[5]。STAT3發(fā)生激活（Y705與S727磷酸化），就會開啟控制抗凋亡、促增殖以及免疫反應(yīng)的基因表達[6-7]。

熱休克蛋白Hsp90是分子伴侶蛋白，在細胞中普遍表達。參與細胞生理以及病理過程的大多數(shù)蛋白發(fā)揮功能都離不開Hsp90的協(xié)助[8]。同正常組織相比，Hsp90表達量在腫瘤細胞有所提高。Hsp90的客戶蛋白，如Akt、Her2、MAPK等，在驅(qū)動腫瘤細胞存活、增殖以及耐藥等方面發(fā)揮重要作用[9]。正因為這樣，Hsp90是一個十分有效的抗腫瘤靶標(biāo)。前期研究中，我們已經(jīng)通過懸浮培養(yǎng)的方法得到食管癌干細胞樣細胞[10]，本研究主要通過沉默STAT3的表達水平研究Hsp90抑制劑SNX-2112誘導(dǎo)食管癌干細胞凋亡的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

Eca109細胞購于中山大學(xué)細胞庫（廣東廣州），CCK8試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司（江蘇海門）。IGF2、EGF、bFGF購于PeproTech公司（江蘇蘇州），B27購于Invitrogen公司（上海），DMEM/F12培養(yǎng)基購于Stem cells公司（上海），澳洲胎牛血清購自Sigma公司（上海），抗生素購于廣州天駿生物公司（廣東廣州）。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購于南京凱基公司（江蘇南京）。Bcl2抗體（#2872）以及Bax抗體（#14796）STAT3抗體（#9139）以及pSTAT3抗體（#4113）購自美國Cell Signaling Technology公司（美國Carlsbad）。STAT3引物及shRNASTAT3、shSTAT3-1慢病毒由上海吉凱公司合成，促轉(zhuǎn)染試劑polybrene（#3614）購自上海吉凱公司。SNX-2112由暨南大學(xué)王一飛教授饋贈。ECL細胞Western blot發(fā)光液購自美國Millipore公司。細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，上海），流式細胞儀（美國BD公司，上海），PCR儀器（BIO-RAD公司，上海）。

1.2 細胞培養(yǎng)

本課題組前期研究通過懸浮成球的培養(yǎng)方法獲得食管癌干細胞[10]，具體方法為使用IMDM無血清培養(yǎng)基（20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF、B27和1%雙抗）培養(yǎng)食管癌細胞Eca109，用超低黏附培養(yǎng)皿。每3～5天半定量更換培養(yǎng)基，周期21天，部分細胞懸浮成球，鑒定并分析成球細胞的性質(zhì)。獲得的食管癌干細胞培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF以及B27，培養(yǎng)基中含有終濃度為1%的青霉素與鏈霉素。將細胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖活性分析

分別收集對數(shù)生長期的食管癌干細胞，用培養(yǎng)液稀釋成細胞懸液，接種于96孔板，每孔接種5 000個細胞，設(shè)3個復(fù)孔、藥物處理組（shSTAT3沉默后再加SNX-2112藥物作用）、DMSO溶劑對照組以及空白對照組。然后置于CO2培養(yǎng)箱孵育24、48和72 h后，加入CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，酶標(biāo)儀測定各孔570 nm處的OD值（光密度值）， 測得吸光度A值。生長抑制率的計算公式為：生長抑制率（%）=（1-OD實驗組/OD對照組）×100%。根據(jù)各濃度的抑制率可作圖得到劑量反應(yīng)曲線。

1.4 細胞凋亡和細胞周期分析

收集shSTAT3沉默后再加SNX-2112藥物作用后的細胞，棄去上清液，并用PBS輕輕重懸并計數(shù)；PBS洗滌細胞3次，收集5×105個細胞；每個樣品加入500 μl結(jié)合液重懸細胞，錫箔紙包好靜置5 min；然后每個樣品再加入5 μl的Annexin-APC凋亡試劑，輕輕混勻，靜置5 min后，再加5 μl 7-AAD凋亡試劑，混勻；室溫下避光孵育15～20 min，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。離心收集藥物作用后的細胞，使細胞數(shù)量在1×106個/毫升， PBS洗滌細胞；加入500 μl PI孵育液，重懸細胞，室溫避光孵育10 min；流式細胞儀檢測細胞周期阻滯。FlowJo分析細胞凋亡與阻滯情況。

1.5 Western blot分析凋亡蛋白變化

1 000 r/min離心5 min收集細胞（先shSTAT3沉默后再加SNX-2112藥物作用），將藥物作用后的細胞用含苯甲基磺酰氟的RIPA（50 μmol/L Tris-HCl, 150 μmol/L NaCl, 1%NP-40, pH7.4）裂解液裂解，置于金屬浴加熱裂解細胞，100℃裂解10 min。使用BCA法得到蛋白濃度，并使用SDS loading buffer溶解細胞，渦旋混勻。蛋白樣品通過12%的SDS-PAGE膠電泳分離開，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉（1%吐溫20的TBS溶液溶解）室溫封閉1 h，TBST緩沖液洗滌膜3次后，將稀釋好的一抗與PVDF膜4℃雜交孵育過夜。次日，TBST洗滌膜三次，加入相應(yīng)的二抗，室溫1 h，利用化學(xué)發(fā)光法顯影檢測。內(nèi)參蛋白使用β-actin作對比進行歸一化處理。

1.6 RNA提取以及qPCR分析

1 000 r/min離心收集藥物作用后的細胞，棄廢液，加1 ml TRIzol裂解液裂解細胞，室溫下靜置5 min；加入0.2 ml氯仿，渦旋振蕩使細胞充分裂解，12 000 r/min、4℃離心15 min，用移液槍輕輕吸取上層液相400 μl，避免擾動下層雜蛋白；加入400 μl異丙醇，混勻，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min，離心5 min， EP管底部有白色沉淀，即為總RNA；棄去上層液，加入1 ml的75%無水乙醇洗滌總RNA沉淀；12 000 r/min，4℃離心5 min，移液槍棄去液體，留下白色沉淀RNA；室溫打開EP管蓋子，待乙醇揮發(fā)，晾干總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃保存。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于下一步的qPCR反應(yīng)過程：STAT3，F(xiàn): 5'-GGGCCCGTTAAGCGGGTTTCCCGG-3'，R: 5'-TTGGGCCAAGGGCCC TTAACCTTAACC-3'。反應(yīng)體積為10 μl，反應(yīng)步驟為二步法，反應(yīng)條件為：1個循環(huán)，95℃ 5 s，60℃ 5 s；42個循環(huán)， 95℃ 15 s ，60℃ 1 min，使用2-ΔΔCt法處理qPCR數(shù)據(jù)。

1.7 軟瓊脂平板實驗

去離子水配制1.0%與0.5%的低熔點瓊脂糖，高溫高壓滅菌，置于40℃水浴保溫使之不凝固；用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（2%青霉素與鏈霉素，40 ng/ml EGF，40 ng/ml bFGF，2倍B27）把分離獲取的食管癌干細胞調(diào)整至密度300個/毫升；用20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基把1.0%的低熔點瓊脂糖液稀釋成0.5%的底層瓊脂；取0.5%的低熔點瓊脂糖，用此瓊脂糖與等體積的含有食管癌干細胞的DMEM/F12混合配成0.25%的上層瓊脂；把上述混勻后含食管癌干細胞的0.25%瓊脂糖液加入6孔板底層瓊脂上，使其形成雙瓊脂層；將6孔板繼續(xù)培養(yǎng)15天；6孔板加入0.25毫升/孔的0.05%結(jié)晶紫溶液，37℃孵育30 min后觀察細胞克隆數(shù)，并計算克隆形成率。計數(shù)大于＞15個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.8 shRNA-STAT3慢病毒轉(zhuǎn)染

設(shè)計shSTAT3慢病毒載體，靶點為5’-GGG TTAAGCTGTAACATACTT-3’，shSTAT3-1的靶點為5’-GTGCTGGCC TTCGGCCAATG-3’，同時設(shè)計靶向GFP為陰性對照，靶點為5'-GGCCGGAATTCCCGGTT-3’，病毒滴度為1.0×108。轉(zhuǎn)染方法為：收集分離后的食管癌干細胞約1.0×106個，加入病毒，并加入促轉(zhuǎn)染試劑polybrene（終濃度為8 μg/ml）輔助病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟按照說明書進行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間采用t檢驗分析，采用Graphpad 5作圖，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNX-2112抑制食管癌干細胞增殖

根據(jù)之前課題組的研究結(jié)果，本課題組已經(jīng)得到食管癌細胞Eca109來源的食管癌干細胞[10]（以下全部稱為食管癌干細胞）。不同濃度（0.015625、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L）SNX-2112作用食管癌干細胞Eca109，24 h后，隨著藥物濃度提高，細胞存活率逐漸降低。48 h后，出現(xiàn)同樣的結(jié)果，細胞增殖受到抑制，見圖1。使用Graphpad 5計算出SNX-2112作用Eca-109細胞24 h與48 h的IC50，分別為（0.28±0.01）μmol/L、（0.05±0.01）μmol/L。Eca109經(jīng)過SNX-2112作用48 h后，細胞的生長較24 h時受到的抑制程度更加明顯，如細胞出現(xiàn)碎片，不利于收集細胞做后續(xù)研究，所以選擇藥物作用時間為24 h，選擇SNX-2112藥物濃度為0.28 μmol/L。

圖1 CCK8實驗分析SNX-2112作用食管癌干細胞24h與48h的活性曲線Figure1 Effect of SNX-2112 on viability of esophageal cancer stem cells after 24 and 48h detected by CCK8

2.2 shSTAT3對STAT3 mRNA及蛋白的影響

為了得到更加有效的沉默效果，課題組設(shè)計了2個沉默STAT3的慢病毒載體，分別為shSTAT3與shSTAT3-1。qPCR結(jié)果顯示，慢病毒載體沉默組（shSTAT3）沉默STAT3 mRNA水平較shSTAT3-1及空白對照組（shGFPctrl）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0062,P=0.0031），shSTAT3-1相對于空白對照組則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.365），見圖2A。Western blot結(jié)果進一步確認shSTAT3的沉默效率，相較于空白對照組，shSTAT3蛋白表達明顯下調(diào)（81.21%,P=0.0053），而shSTAT3-1組STAT3蛋白表達量基本無變化（2.13%,P=1.23），見圖2B。Western blot結(jié)果顯示，相較于shGFPctrl組沉默STAT3的同時，STAT3的活化形式pSTAT3亦受到影響（72.12%,P=0.0005），見圖2B。qPCR及Western blot結(jié)果顯示，shSTAT3可有效抑制食管癌干細胞中STAT3 mRNA及蛋白的表達水平，同時選擇shSTAT3組用于后續(xù)沉默實驗。后續(xù)的實驗處理步驟是，細胞先受到shSTAT3作用，再加藥物SNX-2112作用。

圖2 qPCR(A)和Western blot(B)法分析shSTAT3-1與shSTAT3的沉默效率Figure2 Silence efficiency of shSTAT3-1 and shSTAT3 lentiviral vectors demonstrated by qPCR(A) and Western blot(B)

2.3 沉默STAT3與SNX-2112聯(lián)合應(yīng)用對食管癌干細胞的增殖抑制作用

CCK8實驗顯示：相較于shGFPctrl組，shSTAT3組細胞的生長受到明顯抑制，細胞增殖的曲線趨于平緩（P=0.00062）。相較于PBS組，SNX-2112組細胞的增殖受到明顯抑制（P=0.0048），PBS組與shGFPctrl組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)食管癌干細胞沉默STAT3的同時使用SNX-2112，食管癌干細胞的增殖受到更顯著的抑制（P=0.0001,P=0.00016），見圖3。

圖3 shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合應(yīng)用對食管癌干細胞活性的影響Figure3 Effect of shSTAT3 combined with SNX-2112 on viability of esophageal cancer stem cells

2.4 克隆形成實驗顯示shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合應(yīng)用對食管癌干細胞的增殖抑制作用

軟瓊脂平板實驗顯示，當(dāng)食管癌干細胞受到shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合作用后，細胞克隆效率比例是（1.89±0.14）%，相較于當(dāng)細胞受到shSTAT3作用后細胞克隆效率比例為（18.56±2.31）%以及細胞受到SNX-2112作用后細胞克隆效率比例為（8.71±1.65）%，存在顯著性差異（P=0.0043,P=0.0072），見圖4。

2.5 shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合應(yīng)用對食管癌干細胞凋亡的效果

流式細胞儀實驗顯示，當(dāng)食管癌干細胞受到shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合作用后，細胞的早期凋亡與晚期凋亡的總和（36.34±2.12）%明顯高于單獨作用組shSTAT3（22.32±2.59）%與SNX-2112（29.02±3.22）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002,P=0.003）。PBS組與shGFPctrl組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.125），見圖5。

2.6 shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合應(yīng)用對食管癌干細胞周期的效果

流式細胞儀分析顯示，當(dāng)食管癌干細胞被shSTAT3作用后，subG1比例為（18.27±3.42）%，當(dāng)被SNX-2112作用后，subG1比例為（20.65±2.89）%，當(dāng)被shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合作用后，細胞的subG1比例為（42.52±4.51）%，聯(lián)合用藥組與shSTAT3單獨用藥組、SNX-2112單獨用藥組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0001,P=0.0004），見圖6。結(jié)果表明，沉默STAT3顯著增強SNX-2112誘導(dǎo)食管癌干細胞的subG1比例，凋亡細胞率顯著增加。

圖4 軟瓊脂平板克隆實驗分析shSTAT3與SNX-2112聯(lián)用對克隆形成效率的影響Figure4 Effect of shSTAT3 combined with SNX-2112 on colony efficiency of esophageal cancer stem cells analyzed by soft agar colony formation assay

圖5 流式細胞儀分析藥物聯(lián)用對食管癌干細胞凋亡效果的影響Figure5 Effect of shSTAT3 combined with SNX-2112 on apoptosis of esophageal cancer stem cells analyzed by flow cytometry

2.7 食管癌干細胞受到shSTAT3與SNX-2112聯(lián)合作用后凋亡家族蛋白變化情況

相較于PBS組，SNX-2112作用組Bcl2蛋白表達水平顯著降低（（0.25±0.03）vs.（0.85±0.08）,P=0.00025），Bax水平提高（（0.98±0.09）vs.（0.25±0.04）,P=0.0032）；同樣相較于shGFPctrl組，沉默STAT3降低Bcl2蛋白水平（（0.33±0.08）vs.（0.96±0.07）,P=0.0018），Bax表達水平提高（（0.93±0.06）vs.（0.26±0.04）,P=0.00093）。當(dāng)食管癌干細胞受到兩者聯(lián)合作用時，Bcl2表達水平顯著降低（0.11±0.03）（P=0.0046），Bax水平提高（0.98±0.07）（P=0.0058），見圖7。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性行為的種子。腫瘤干細胞是具有啟動腫瘤發(fā)生性質(zhì)的一小部分細胞。美國科學(xué)家最早發(fā)現(xiàn)白血病干細胞的存在，提出了“白血病干細胞等級學(xué)說”模型[11]。后來，逐漸在其他類型腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有腫瘤干細胞的存在，如膠質(zhì)瘤[12]、乳腺癌[13]、結(jié)腸癌[14]、胰腺癌[15]等。根據(jù)這些研究，腫瘤疾病的治療在于是否能夠消除腫瘤干細胞的存在。

圖6 流式細胞儀分析藥物聯(lián)用對食管癌干細胞亞G1期的影響Figure6 Effect of shSTAT3 combined with SNX-2112 on subG1 phase of esophageal cancer stem cells analyzed by flow cytometry

圖7 Western blot分析藥物聯(lián)用對凋亡蛋白Bcl2與Bax水平的影響Figure7 Effect of shSTAT3 combined with SNX-2112 on Bcl2 and Bax expression in esophageal cancer stem cells detected by Western blot

3.1 腫瘤干細胞與食管癌干細胞

腫瘤干細胞的獲取通常有三種方法：（1）通過細胞表面標(biāo)志物，如膠質(zhì)瘤干細胞CD133[12]、胃癌干細胞CD90[16]；（2）通過流式細胞儀分選側(cè)群細胞（side population）[17]；（3）通過無血清懸浮培養(yǎng)[18]。腫瘤干細胞學(xué)說認為臨床腫瘤疾病治療的失敗主要歸因于腫瘤干細胞的存在。腫瘤干細胞受到多種因素的調(diào)控，如腫瘤微環(huán)境、干性因子Nanog、Oct4、Sox2、Bmi-1及STAT3。如Bmi-1通過Nanog調(diào)控乳腺癌細胞的自我更新、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。再如Nanog對于膠質(zhì)瘤干細胞的性質(zhì)也是重要的，沉默Nanog能夠有效抑制膠質(zhì)瘤干細胞的克隆形成能力、體內(nèi)成瘤能力等[20]。除此之外，通過聯(lián)合抑制Nanog以及Oct4能夠有效抑制口腔癌干細胞的耐藥、轉(zhuǎn)移等性質(zhì)[21]。Lu等的研究顯示，敲除Nanog與Oct4降低胰腺癌干性性質(zhì)，如轉(zhuǎn)移能力與成瘤能力[22]。STAT3對于胚胎干細胞以及造血干細胞自我更新的信號通路是至關(guān)重要的[23-24]。在腫瘤細胞、腫瘤干細胞中STAT3同樣也起到重要的生物學(xué)作用，如有作者直接把STAT3看作癌基因[25]。STAT3與腫瘤干細胞的EMT能力有重要關(guān)系[26]。以上研究結(jié)果表明，STAT3等干性因子對腫瘤干細胞的增殖、成瘤等性質(zhì)是不可或缺的。

3.2 STAT3與腫瘤細胞、腫瘤干細胞的關(guān)系

STATs家族包含七個成員，分別是：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。不論是對正常細胞還是腫瘤細胞，STAT3都起到重要的生長調(diào)控作用。STAT3的異?；罨粌H在食管癌干細胞被發(fā)現(xiàn)，在其他腫瘤細胞如膠質(zhì)瘤、白血病、乳腺癌、肝癌、前列腺癌也存在異?；罨那闆r。有研究表明，在腫瘤細胞異?；罨腟TAT3不僅提高了抗凋亡蛋白（Bcl-xL、Mcl-1）的水平，還提高了細胞周期調(diào)控蛋白（cyclin D1、c-Myc）的表達水平[27]。因此，組成性活化STAT3的腫瘤細胞對凋亡信號以及其他能夠引起凋亡信號的化療藥物有一定的抵抗性。盡管如此，還是有很多針對STAT3異常活化的化合物被設(shè)計及開發(fā)出來。這些藥物在臨床前期顯示出一定的抗腫瘤效果[5]。

STAT3對于調(diào)控腫瘤干細胞的表型基因以及標(biāo)志物基因有重要作用[27]，常見的腫瘤干細胞標(biāo)志物如CD24、CD34、CD38、CD44、CD90、CD133以及乙醛脫氫酶[28]。Zhang等研究顯示，STAT3更傾向于表達在腫瘤干細胞[29]。在三陰性乳腺癌中STAT3與Her2的表達呈正相關(guān)的關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)STAT3的激活與乳腺癌干細胞的干性性質(zhì)具有相關(guān)性[30]。在我們以往的研究中發(fā)現(xiàn)STAT3在食管癌干細胞也是異?；罨磉_[10]。STAT3的Y705與S721發(fā)生磷酸化會導(dǎo)致STAT3轉(zhuǎn)變?yōu)閜STAT3，pSTAT3入核介導(dǎo)基因的表達與調(diào)控，如mRNA轉(zhuǎn)錄[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)沉默STAT3后降低了其磷酸化活化蛋白的表達量，增強了SNX-2112誘導(dǎo)食管癌干細胞凋亡。

3.3 Hsp90與腫瘤細胞、腫瘤干細胞的關(guān)系

Hsp90是高度保守的分子伴侶蛋白，主要調(diào)控其客戶蛋白達到正確的構(gòu)象，參與腫瘤細胞的增殖、耐藥、轉(zhuǎn)移、侵襲等。Hsp90的客戶蛋白主要包括激酶以及轉(zhuǎn)錄因子[31]。與傳統(tǒng)的腫瘤單一靶點藥物相比，Hsp90抑制劑能夠抑制多條信號通路從而阻斷腫瘤細胞以及腫瘤干細胞的增殖、存活等細胞生物學(xué)行為[32]。腫瘤干細胞的眾多信號通路需要Hsp90的參與，這意味著將Hsp90抑制劑開發(fā)成抗腫瘤干細胞藥物具有很大的可行性。Subramanian等研究指出，Hsp90抑制劑KU711能夠有效抑制頭頸癌干細胞增殖，細胞標(biāo)志物蛋白CD44、乙醛脫氫酶、干性因子Bmi-1表達量顯著降低[33]。本研究發(fā)現(xiàn)Hsp90抑制劑能夠有效誘導(dǎo)食管癌干細胞凋亡，在沉默STAT3的情況下這一效果更加明顯。

綜上所述，本實驗主要研究了沉默STAT3增強了Hsp90抑制劑SNX-2112誘導(dǎo)食管癌干細胞凋亡的效果。研究結(jié)果提示，STAT3與SNX-2112聯(lián)用可能為食管癌的臨床治療提供新的思路。