潘望平，鄔姍，呂曉君，何開勇

(湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院生物安全檢測中心，武漢 430064)

注射用還原型谷胱甘肽是用于抗癌藥物解毒、放療損傷預(yù)防，對酒精性肝中毒和各種原因引起的肝損傷有保護(hù)作用[1-2]。肌肉刺激實驗是肌內(nèi)注射類藥物的安全性評價檢查項目之一[3]，為保證其臨床用藥的安全、有效，本研究參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求對其進(jìn)行肌肉刺激實驗[4-6]。注射用還原型谷胱甘肽在臨床使用中是用注射用水或0.9%氯化鈉注射液溶解后進(jìn)行注射，因此本實驗比較3個廠家的受試藥品用兩種溶媒配制的供試液對家兔的肌肉刺激結(jié)果，評價其安全性，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1受試藥品 注射用還原型谷胱甘肽3批：受試藥品1，規(guī)格：每支0.6 g，批號：31504231，武漢大安制藥股份有限公司生產(chǎn)；受試藥品2，規(guī)格：每支0.6 g，批號：14021180，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)；受試藥品3，規(guī)格：每支0.6 g，批號：131159，意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(chǎn)(原研對照制劑)。人臨床肌肉注射擬用最高濃度為0.3 g·mL-1。溶媒A：0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：每瓶100 mL，批號：140307703)；溶媒B：滅菌注射用水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，規(guī)格：每瓶100 mL，批號：130922-1)。

1.2儀器 動物秤(型號：XS6001S，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；BX53 型顯微鏡(日本Olympus 公司)。

1.3實驗動物 普通級日本大耳白兔96只，雌雄不限，體質(zhì)量為2.3～2.8 kg，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2011-0011。家兔飼養(yǎng)于湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，普通環(huán)境，溫度為16～26 ℃，相對濕度40%～70%，實驗動物使用許可證：SYXK(鄂)2014-0009。

1.4動物分組 96只家兔按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方法分成12組，每組8只，按不同生產(chǎn)廠家、溶媒、劑量分別編號為1A-H、1A-L、1B-H、1B-L、2A-H、2A-L、2B-H、2B-L、3A-H、3A-L、3B-H、3B-L，見表1。

1.5受試藥品溶液配制 取注射用還原型谷胱甘肽6支，加0.9%氯化鈉注射液或注射用水至12 mL，濃度為0.3 g·mL-1(大劑量組)；取注射用還原型谷胱甘肽3支，加0.9%氯化鈉注射液或注射用水至12 mL，濃度為0.15 g·mL-1(小劑量組)。

1.6給藥方法 采用同體左右側(cè)自身對比法。剪去兩側(cè)股四頭肌部位的兔毛，消毒皮膚后，家兔左側(cè)股四頭肌給予受試藥品溶液，右側(cè)股四頭肌給予溶媒。注射體積均為每側(cè)1 mL，單次給藥[7-8]。

1.7觀察指標(biāo) 于給藥后72 h，每組取4只家兔處死，解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察肌肉組織的顏色、光澤，有無充血、水腫、變性或壞死，按肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)計算相應(yīng)的反應(yīng)級，并取兩側(cè)注射部位肌肉組織，常規(guī)處理，作組織病理學(xué)檢查；于給藥后14 d，每組處死剩余4只家兔，同法剖檢觀察局部反應(yīng)并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，以了解肌肉刺激反應(yīng)的持續(xù)狀況或可逆性。

表1家兔的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方法

Tab.1Randomizedblockdesignmethodofrabbits

組別生產(chǎn)廠家溶媒劑量編號1武漢大安0.9%氯化鈉注射液大劑量1A-H2武漢大安0.9%氯化鈉注射液小劑量1A-L3武漢大安注射用水大劑量1B-H4武漢大安注射用水小劑量1B-L5重慶藥友0.9%氯化鈉注射液大劑量2A-H6重慶藥友0.9%氯化鈉注射液小劑量2A-L7重慶藥友注射用水大劑量2B-H8重慶藥友注射用水小劑量2B-L9意大利福斯卡瑪0.9%氯化鈉注射液大劑量3A-H10意大利福斯卡瑪0.9%氯化鈉注射液小劑量3A-L11意大利福斯卡瑪注射用水大劑量3B-H12意大利福斯卡瑪注射用水小劑量3B-L

1.8結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)計算肌肉刺激性總反應(yīng)級，計算平均值，判定刺激等級，并結(jié)合組織病理學(xué)檢查的結(jié)果進(jìn)行綜合評價。肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)：無明顯變化，0分；輕度充血，其范圍在0.5 cm×1.0 cm以下，1分；中度充血，其范圍在0.5 cm×1.0 cm以上，2分；重度充血，伴有肌肉變性，3分；出現(xiàn)壞死，有褐色變性，4分；出現(xiàn)廣泛性壞死，5分。平均分值為0.0～0.4，無刺激；0.5～1.4，輕微刺激；1.5～2.4，輕度刺激；2.5～3.4，中度刺激；3.5～4.4，重度刺激；4.5及以上，嚴(yán)重刺激。

2 結(jié)果

2.1肉眼觀察及評分結(jié)果 結(jié)果見圖1，2和表2。家兔肌肉注射給藥72 h后，0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組家兔肌肉組織未見異常(圖1A)，無肌肉刺激反應(yīng)；注射用水溶媒對照組家兔肌肉有中度到重度充血(圖1B)，肌肉刺激反應(yīng)平均分值為3.0～3.25，說明注射用水作為溶媒對照有中度肌肉刺激反應(yīng)。受試藥品1(武漢大安)、受試藥品2(重慶藥友)、受試藥品3(意大利福斯卡瑪)用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量藥液在給藥后72 h后，家兔出現(xiàn)不同程度的肌肉刺激反應(yīng)(圖1C，1G，1K)，平均分值分別為2.25，3.25，1.25，刺激反應(yīng)分級分別為輕度、中度、輕微；而用注射用水配制的大劑量藥液對家兔肌肉刺激反應(yīng)平均分值分別為3.5，3.75，3.5，刺激反應(yīng)分級均為重度刺激(圖1D，1H，1L)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的小劑量藥液對家兔的肌肉刺激反應(yīng)平均分值分別為0，0.5，0，刺激反應(yīng)分級分別為無、輕微、無(圖1E，1I，1M)；而用注射用水配制的小劑量藥液對家兔肌肉刺激反應(yīng)平均分值分別為3.0，3.0，3.5，刺激反應(yīng)分級均為中度刺激(圖1F，1J，1N)。家兔肌肉注射給藥14 d后，受試藥品2用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量組有1只家兔的注射部位出現(xiàn)白色增生組織(圖2A)，用注射用水配制的大劑量組4只家兔均出現(xiàn)肌肉變性、增生結(jié)節(jié)組織(圖2B)；0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組、注射用水溶媒對照組、受試藥品1和受試藥品3用兩種溶媒配制的大、小劑量組、受試藥品2用兩種溶媒配制的小劑量組家兔肌肉組織肉眼觀察均未見異常。

2.2組織病理學(xué)檢查結(jié)果 家兔肌肉注射給藥后72 h肌肉組織病理學(xué)檢查結(jié)果如圖3所示。0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組的給藥部位肌纖維組織結(jié)構(gòu)完整，無變性、壞死，未見炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(圖3A)，注射用水溶媒對照組的給藥部位肌纖維壞死，中度出血及大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖3B)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量藥液在給藥后72 h后家兔注射部位肌肉組織出現(xiàn)不同程度的出血、炎癥細(xì)胞浸潤和肌纖維變性壞死，其中受試藥品2肌纖維壞死程度及范圍最嚴(yán)重(圖3G)、受試藥品1 其次(圖3C)、受試藥品3最輕(圖3K)；用注射用水配制的大劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織均出現(xiàn)大量出血及炎癥細(xì)胞浸潤，肌纖維大范圍壞死、溶解、變性(圖3E，3I，3M)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的小劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織病理學(xué)檢查均未見明顯異常(圖3D，3H，3L)；而用注射用水配制的小劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織均出現(xiàn)中度出血、炎癥細(xì)胞浸潤和肌纖維變性(圖3F，3J，3N)。家兔肌肉注射給藥后14 d肌肉組織病理學(xué)檢查結(jié)果如圖4所示。受試藥品2用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量組有1只家兔的注射部位出現(xiàn)結(jié)締組織增生并形成結(jié)節(jié)(圖4A)，用注射用水的大劑量組4只家兔注射部位均有不同程度結(jié)締組織增生并形成結(jié)節(jié)(圖4B)；0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組、注射用水溶媒對照組、受試藥品1和受試藥品3用兩種溶媒配制的大、小劑量組、受試藥品2用兩種溶媒配制的小劑量組家兔注射部位肌肉組織病理學(xué)檢查均未見異常。

A.0.9%氯化鈉注射液組；B.注射用水組；C.1A-H受試藥品組；D.1B-H受試藥品組；E.1A-L受試藥品組；F.1B-L受試藥品組；G.2A-H受試藥品組；H.2B-H受試藥品組；I.2A-L受試藥品組；J.2B-L受試藥品組；K.3A-H受試藥品組；L.3B-H 受試藥品組；M.3A-L受試藥品組；N.3B-L受試藥品組

圖1家兔給藥后72h肌肉刺激肉眼觀察結(jié)果(1：2.5)

A.0.9% sodium chloride injection group；B. water for injection group；C. test drug 1A-H group；D. test drug 1B-H group；E. test drug 1A-L group；F. test drug 1B-L group；G. test drug 2A-H group；H. test drug 2B-H group；I. test drug 2A-L group；J. test drug 2B-L group；K. test drug 3A-H group；L. test drug 3B-H group；M. test drug 3A-L group；N. test drug 3B-L group

Fig.1Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation72hoursafterintromuscleinjection(1：2.5)

表2家兔給藥后72h肌肉刺激反應(yīng)積分和分級

Tab.2Scoresandgradingofmuscularstimulationresponseofrabbits72hoursafterintromuscleinjection

組別家兔/只左側(cè)(受試藥品)每只家兔積分平均分等級右側(cè)(溶媒)每只家兔積分平均分等級1A-H組433122.25輕度00000無1A-L組400000無00000無1B-H組444333.50重度33343.25中度1B-L組433333.00中度33333.00中度2A-H組433343.25中度00000無2A-L組411000.50輕微00000無2B-H組444433.75重度33343.25中度2B-L組433333.00中度34333.25中度3A-H組422101.25輕微00000無3A-L組400000無00000無3B-H組433443.50重度33343.25中度3B-L組433333.00中度33333.00中度

組別：1.武漢大安；2.重慶藥友；3.意大利福斯卡瑪；A.0.9%氯化鈉注射液；B.注射用水；H.大劑量；L.小劑量

Groups：1.Wuhan，daan； 2.Chongqing，yaoyou； 3.Italy，F(xiàn)oscama；A.0.9% sodium chloride injection； B.water for injection； H.high dose； L.low dose

A.2A-H受試藥品組； B.2B-H受試藥品組

圖2家兔給藥后14d肌肉刺激肉眼觀察結(jié)果(1：2.5)

A. test drug 2A-H group；B. test drug 2B-H group

Fig.2Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation14dayafterintromuscleinjection(1：2.5)

3 討論

本實驗觀察3個不同廠家的注射還原型用谷胱甘肽分別用0.9%氯化鈉注射液和注射用水溶解后對家兔進(jìn)行單次給藥的肌肉刺激作用：受試藥品設(shè)置大、小兩個劑量，給藥后72 h和14 d進(jìn)行大體觀察評分和組織病理學(xué)檢查，以比較兩種溶媒配制的受試藥品對家兔肌肉刺激有無差異，并比較3個不同廠家的受試藥品的肌肉刺激性。結(jié)果顯示，根據(jù)給藥后72 h的大體觀察結(jié)果及組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行分級，0.9%氯化鈉注射液作為溶媒時，受試藥品1(武漢大安)、受試藥品2(重慶藥友)、受試藥品3(意大利福斯卡瑪)大劑量組肌肉刺激反應(yīng)分別為輕度、中度、輕微，小劑量組肌肉刺激反應(yīng)分別為無、輕微、無；注射用水作為溶媒時，大劑量組肌肉刺激反應(yīng)均為重度，小劑量組肌肉刺激反應(yīng)均為中度，說明用注射用水作為溶媒配制受試藥品比0.9%氯化鈉注射液作為溶媒的肌肉刺激反應(yīng)大，且大劑量比小劑量的肌肉刺激反應(yīng)大，其中受試藥品2的肌肉刺激性最大，受試藥品1其次，受試藥品3最小。給藥14 d后，大體觀察和病理學(xué)結(jié)果表明，受試藥品2大劑量對家兔所致的肌肉刺激為不可逆，家兔肌肉有結(jié)締組織增生和白色結(jié)節(jié)，且用注射用水作為溶媒配制受試藥品比0.9%氯化鈉注射液作為溶媒導(dǎo)致的不可逆損傷更為嚴(yán)重；受試藥品1和受試藥品3對家兔的肌肉刺激性為可逆的。受試藥品3為意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(chǎn)，是注射還原型用谷胱甘肽原研對照制劑，在本次實驗中肌肉刺激性最輕，提示我國仿制藥品與原研藥還是存在差別。

3個不同廠家的注射用還原型谷胱甘肽的肌肉刺激結(jié)果均顯示注射用水作為溶媒比0.9%氯化鈉注射液的肌肉刺激性大，可能是因為用注射用水配制的藥液為低滲溶液，短時、快速地進(jìn)入肌肉組織后引起肌細(xì)胞腫脹、溶解至72 h后發(fā)生變性壞死；而用0.9%氯化鈉注射液配制的藥液為等滲溶液，注射后肌肉刺激較注射用水輕；且注射用水溶媒組亦出現(xiàn)中度肌肉刺激性。因此，用注射用水配制的藥液引起的肌肉刺激反應(yīng)可能有一部分是來自注射用水而不僅僅是受試藥品，可認(rèn)為用注射用水配制注射用還原型谷胱甘肽，加重其肌肉刺激反應(yīng)，建議在臨床使用時用0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行配制。

A.0.9%氯化鈉注射液組；B.注射用水組；C.1A-H受試藥品組；D.1A-L受試藥品組；E.1B-H受試藥品組；F.1B-L受試藥品組；G.2A-H受試藥品組；H.2A-L受試藥品組；I.2B-H受試藥品組；J.2B-L受試藥品組；K.3A-H受試藥品組；L.3A-L受試藥品組；M.3B-H受試藥品組；N.3B-L受試藥品組

圖3家兔給藥后72h肌肉組織病理圖(HE染色，×100)

A.0.9% sodium chloride injection group；B. water for injection group；C. test drug 1A-H group；D. test drug 1A-L group；E. test drug 1B-H group；F. test drug 1B-L group；G. test drug 2A-H group；H. test drug 2A-L group；I. test drug 2B-H group；J. test drug 2B-L group；K. test drug 3A-H group；L. test drug 3A-L group；M.test drug 3B-H group；N. test drug 3B-L group

Fig.3Histopathologicalimagesofrabbitsmuscle72hoursafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

A.2A-H受試藥品組； B.2B-H受試藥品組

圖4家兔給藥后14d肌肉組織病理圖(HE染色，×100)

A. test drug 2A-H group；B. test drug 2B-H group

Fig.4Histopathologicalexaminationofrabbitsmuscle14daysafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

綜上所述，注射用還原型谷胱甘肽用0.9%氯化鈉注射液做溶媒比注射用水的肌肉刺激反應(yīng)輕，且原研制劑的肌肉刺激最輕。為保障公眾用藥安全和提升我國仿制藥質(zhì)量提供實驗參考依據(jù)。