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        不同溶媒注射用還原型谷胱甘肽的肌肉刺激性實驗

        2019-04-02 02:30:08潘望平鄔姍呂曉君何開勇
        醫(yī)藥導(dǎo)報 2019年4期
        關(guān)鍵詞:溶媒家兔氯化鈉

        潘望平,鄔姍,呂曉君,何開勇

        (湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院生物安全檢測中心,武漢 430064)

        注射用還原型谷胱甘肽是用于抗癌藥物解毒、放療損傷預(yù)防,對酒精性肝中毒和各種原因引起的肝損傷有保護(hù)作用[1-2]。肌肉刺激實驗是肌內(nèi)注射類藥物的安全性評價檢查項目之一[3],為保證其臨床用藥的安全、有效,本研究參照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求對其進(jìn)行肌肉刺激實驗[4-6]。注射用還原型谷胱甘肽在臨床使用中是用注射用水或0.9%氯化鈉注射液溶解后進(jìn)行注射,因此本實驗比較3個廠家的受試藥品用兩種溶媒配制的供試液對家兔的肌肉刺激結(jié)果,評價其安全性,為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1受試藥品 注射用還原型谷胱甘肽3批:受試藥品1,規(guī)格:每支0.6 g,批號:31504231,武漢大安制藥股份有限公司生產(chǎn);受試藥品2,規(guī)格:每支0.6 g,批號:14021180,重慶藥友制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn);受試藥品3,規(guī)格:每支0.6 g,批號:131159,意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(chǎn)(原研對照制劑)。人臨床肌肉注射擬用最高濃度為0.3 g·mL-1。溶媒A:0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,規(guī)格:每瓶100 mL,批號:140307703);溶媒B:滅菌注射用水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,規(guī)格:每瓶100 mL,批號:130922-1)。

        1.2儀器 動物秤(型號:XS6001S,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);BX53 型顯微鏡(日本Olympus 公司)。

        1.3實驗動物 普通級日本大耳白兔96只,雌雄不限,體質(zhì)量為2.3~2.8 kg,由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2011-0011。家兔飼養(yǎng)于湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院,普通環(huán)境,溫度為16~26 ℃,相對濕度40%~70%,實驗動物使用許可證:SYXK(鄂)2014-0009。

        1.4動物分組 96只家兔按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方法分成12組,每組8只,按不同生產(chǎn)廠家、溶媒、劑量分別編號為1A-H、1A-L、1B-H、1B-L、2A-H、2A-L、2B-H、2B-L、3A-H、3A-L、3B-H、3B-L,見表1。

        1.5受試藥品溶液配制 取注射用還原型谷胱甘肽6支,加0.9%氯化鈉注射液或注射用水至12 mL,濃度為0.3 g·mL-1(大劑量組);取注射用還原型谷胱甘肽3支,加0.9%氯化鈉注射液或注射用水至12 mL,濃度為0.15 g·mL-1(小劑量組)。

        1.6給藥方法 采用同體左右側(cè)自身對比法。剪去兩側(cè)股四頭肌部位的兔毛,消毒皮膚后,家兔左側(cè)股四頭肌給予受試藥品溶液,右側(cè)股四頭肌給予溶媒。注射體積均為每側(cè)1 mL,單次給藥[7-8]。

        1.7觀察指標(biāo) 于給藥后72 h,每組取4只家兔處死,解剖取出股四頭肌,縱向切開,觀察肌肉組織的顏色、光澤,有無充血、水腫、變性或壞死,按肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)計算相應(yīng)的反應(yīng)級,并取兩側(cè)注射部位肌肉組織,常規(guī)處理,作組織病理學(xué)檢查;于給藥后14 d,每組處死剩余4只家兔,同法剖檢觀察局部反應(yīng)并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,以了解肌肉刺激反應(yīng)的持續(xù)狀況或可逆性。

        表1家兔的隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方法

        Tab.1Randomizedblockdesignmethodofrabbits

        組別生產(chǎn)廠家溶媒劑量編號1武漢大安0.9%氯化鈉注射液大劑量1A-H2武漢大安0.9%氯化鈉注射液小劑量1A-L3武漢大安注射用水大劑量1B-H4武漢大安注射用水小劑量1B-L5重慶藥友0.9%氯化鈉注射液大劑量2A-H6重慶藥友0.9%氯化鈉注射液小劑量2A-L7重慶藥友注射用水大劑量2B-H8重慶藥友注射用水小劑量2B-L9意大利福斯卡瑪0.9%氯化鈉注射液大劑量3A-H10意大利福斯卡瑪0.9%氯化鈉注射液小劑量3A-L11意大利福斯卡瑪注射用水大劑量3B-H12意大利福斯卡瑪注射用水小劑量3B-L

        1.8結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)計算肌肉刺激性總反應(yīng)級,計算平均值,判定刺激等級,并結(jié)合組織病理學(xué)檢查的結(jié)果進(jìn)行綜合評價。肌肉刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn):無明顯變化,0分;輕度充血,其范圍在0.5 cm×1.0 cm以下,1分;中度充血,其范圍在0.5 cm×1.0 cm以上,2分;重度充血,伴有肌肉變性,3分;出現(xiàn)壞死,有褐色變性,4分;出現(xiàn)廣泛性壞死,5分。平均分值為0.0~0.4,無刺激;0.5~1.4,輕微刺激;1.5~2.4,輕度刺激;2.5~3.4,中度刺激;3.5~4.4,重度刺激;4.5及以上,嚴(yán)重刺激。

        2 結(jié)果

        2.1肉眼觀察及評分結(jié)果 結(jié)果見圖1,2和表2。家兔肌肉注射給藥72 h后,0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組家兔肌肉組織未見異常(圖1A),無肌肉刺激反應(yīng);注射用水溶媒對照組家兔肌肉有中度到重度充血(圖1B),肌肉刺激反應(yīng)平均分值為3.0~3.25,說明注射用水作為溶媒對照有中度肌肉刺激反應(yīng)。受試藥品1(武漢大安)、受試藥品2(重慶藥友)、受試藥品3(意大利福斯卡瑪)用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量藥液在給藥后72 h后,家兔出現(xiàn)不同程度的肌肉刺激反應(yīng)(圖1C,1G,1K),平均分值分別為2.25,3.25,1.25,刺激反應(yīng)分級分別為輕度、中度、輕微;而用注射用水配制的大劑量藥液對家兔肌肉刺激反應(yīng)平均分值分別為3.5,3.75,3.5,刺激反應(yīng)分級均為重度刺激(圖1D,1H,1L)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的小劑量藥液對家兔的肌肉刺激反應(yīng)平均分值分別為0,0.5,0,刺激反應(yīng)分級分別為無、輕微、無(圖1E,1I,1M);而用注射用水配制的小劑量藥液對家兔肌肉刺激反應(yīng)平均分值分別為3.0,3.0,3.5,刺激反應(yīng)分級均為中度刺激(圖1F,1J,1N)。家兔肌肉注射給藥14 d后,受試藥品2用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量組有1只家兔的注射部位出現(xiàn)白色增生組織(圖2A),用注射用水配制的大劑量組4只家兔均出現(xiàn)肌肉變性、增生結(jié)節(jié)組織(圖2B);0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組、注射用水溶媒對照組、受試藥品1和受試藥品3用兩種溶媒配制的大、小劑量組、受試藥品2用兩種溶媒配制的小劑量組家兔肌肉組織肉眼觀察均未見異常。

        2.2組織病理學(xué)檢查結(jié)果 家兔肌肉注射給藥后72 h肌肉組織病理學(xué)檢查結(jié)果如圖3所示。0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組的給藥部位肌纖維組織結(jié)構(gòu)完整,無變性、壞死,未見炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象(圖3A),注射用水溶媒對照組的給藥部位肌纖維壞死,中度出血及大量炎癥細(xì)胞浸潤(圖3B)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量藥液在給藥后72 h后家兔注射部位肌肉組織出現(xiàn)不同程度的出血、炎癥細(xì)胞浸潤和肌纖維變性壞死,其中受試藥品2肌纖維壞死程度及范圍最嚴(yán)重(圖3G)、受試藥品1 其次(圖3C)、受試藥品3最輕(圖3K);用注射用水配制的大劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織均出現(xiàn)大量出血及炎癥細(xì)胞浸潤,肌纖維大范圍壞死、溶解、變性(圖3E,3I,3M)。受試藥品1、受試藥品2、受試藥品3用0.9%氯化鈉注射液配制的小劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織病理學(xué)檢查均未見明顯異常(圖3D,3H,3L);而用注射用水配制的小劑量藥液組家兔注射部位肌肉組織均出現(xiàn)中度出血、炎癥細(xì)胞浸潤和肌纖維變性(圖3F,3J,3N)。家兔肌肉注射給藥后14 d肌肉組織病理學(xué)檢查結(jié)果如圖4所示。受試藥品2用0.9%氯化鈉注射液配制的大劑量組有1只家兔的注射部位出現(xiàn)結(jié)締組織增生并形成結(jié)節(jié)(圖4A),用注射用水的大劑量組4只家兔注射部位均有不同程度結(jié)締組織增生并形成結(jié)節(jié)(圖4B);0.9%氯化鈉注射液溶媒對照組、注射用水溶媒對照組、受試藥品1和受試藥品3用兩種溶媒配制的大、小劑量組、受試藥品2用兩種溶媒配制的小劑量組家兔注射部位肌肉組織病理學(xué)檢查均未見異常。

        A.0.9%氯化鈉注射液組;B.注射用水組;C.1A-H受試藥品組;D.1B-H受試藥品組;E.1A-L受試藥品組;F.1B-L受試藥品組;G.2A-H受試藥品組;H.2B-H受試藥品組;I.2A-L受試藥品組;J.2B-L受試藥品組;K.3A-H受試藥品組;L.3B-H 受試藥品組;M.3A-L受試藥品組;N.3B-L受試藥品組

        圖1家兔給藥后72h肌肉刺激肉眼觀察結(jié)果(1:2.5)

        A.0.9% sodium chloride injection group;B. water for injection group;C. test drug 1A-H group;D. test drug 1B-H group;E. test drug 1A-L group;F. test drug 1B-L group;G. test drug 2A-H group;H. test drug 2B-H group;I. test drug 2A-L group;J. test drug 2B-L group;K. test drug 3A-H group;L. test drug 3B-H group;M. test drug 3A-L group;N. test drug 3B-L group

        Fig.1Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation72hoursafterintromuscleinjection(1:2.5)

        表2家兔給藥后72h肌肉刺激反應(yīng)積分和分級

        Tab.2Scoresandgradingofmuscularstimulationresponseofrabbits72hoursafterintromuscleinjection

        組別家兔/只左側(cè)(受試藥品)每只家兔積分平均分等級右側(cè)(溶媒)每只家兔積分平均分等級1A-H組433122.25輕度00000無1A-L組400000無00000無1B-H組444333.50重度33343.25中度1B-L組433333.00中度33333.00中度2A-H組433343.25中度00000無2A-L組411000.50輕微00000無2B-H組444433.75重度33343.25中度2B-L組433333.00中度34333.25中度3A-H組422101.25輕微00000無3A-L組400000無00000無3B-H組433443.50重度33343.25中度3B-L組433333.00中度33333.00中度

        組別:1.武漢大安;2.重慶藥友;3.意大利福斯卡瑪;A.0.9%氯化鈉注射液;B.注射用水;H.大劑量;L.小劑量

        Groups:1.Wuhan,daan; 2.Chongqing,yaoyou; 3.Italy,F(xiàn)oscama;A.0.9% sodium chloride injection; B.water for injection; H.high dose; L.low dose

        A.2A-H受試藥品組; B.2B-H受試藥品組

        圖2家兔給藥后14d肌肉刺激肉眼觀察結(jié)果(1:2.5)

        A. test drug 2A-H group;B. test drug 2B-H group

        Fig.2Resultsofmuscularstimulationresponseofrabbitsbyvisualobservation14dayafterintromuscleinjection(1:2.5)

        3 討論

        本實驗觀察3個不同廠家的注射還原型用谷胱甘肽分別用0.9%氯化鈉注射液和注射用水溶解后對家兔進(jìn)行單次給藥的肌肉刺激作用:受試藥品設(shè)置大、小兩個劑量,給藥后72 h和14 d進(jìn)行大體觀察評分和組織病理學(xué)檢查,以比較兩種溶媒配制的受試藥品對家兔肌肉刺激有無差異,并比較3個不同廠家的受試藥品的肌肉刺激性。結(jié)果顯示,根據(jù)給藥后72 h的大體觀察結(jié)果及組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行分級,0.9%氯化鈉注射液作為溶媒時,受試藥品1(武漢大安)、受試藥品2(重慶藥友)、受試藥品3(意大利福斯卡瑪)大劑量組肌肉刺激反應(yīng)分別為輕度、中度、輕微,小劑量組肌肉刺激反應(yīng)分別為無、輕微、無;注射用水作為溶媒時,大劑量組肌肉刺激反應(yīng)均為重度,小劑量組肌肉刺激反應(yīng)均為中度,說明用注射用水作為溶媒配制受試藥品比0.9%氯化鈉注射液作為溶媒的肌肉刺激反應(yīng)大,且大劑量比小劑量的肌肉刺激反應(yīng)大,其中受試藥品2的肌肉刺激性最大,受試藥品1其次,受試藥品3最小。給藥14 d后,大體觀察和病理學(xué)結(jié)果表明,受試藥品2大劑量對家兔所致的肌肉刺激為不可逆,家兔肌肉有結(jié)締組織增生和白色結(jié)節(jié),且用注射用水作為溶媒配制受試藥品比0.9%氯化鈉注射液作為溶媒導(dǎo)致的不可逆損傷更為嚴(yán)重;受試藥品1和受試藥品3對家兔的肌肉刺激性為可逆的。受試藥品3為意大利福斯卡瑪生化制藥公司生產(chǎn),是注射還原型用谷胱甘肽原研對照制劑,在本次實驗中肌肉刺激性最輕,提示我國仿制藥品與原研藥還是存在差別。

        3個不同廠家的注射用還原型谷胱甘肽的肌肉刺激結(jié)果均顯示注射用水作為溶媒比0.9%氯化鈉注射液的肌肉刺激性大,可能是因為用注射用水配制的藥液為低滲溶液,短時、快速地進(jìn)入肌肉組織后引起肌細(xì)胞腫脹、溶解至72 h后發(fā)生變性壞死;而用0.9%氯化鈉注射液配制的藥液為等滲溶液,注射后肌肉刺激較注射用水輕;且注射用水溶媒組亦出現(xiàn)中度肌肉刺激性。因此,用注射用水配制的藥液引起的肌肉刺激反應(yīng)可能有一部分是來自注射用水而不僅僅是受試藥品,可認(rèn)為用注射用水配制注射用還原型谷胱甘肽,加重其肌肉刺激反應(yīng),建議在臨床使用時用0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行配制。

        A.0.9%氯化鈉注射液組;B.注射用水組;C.1A-H受試藥品組;D.1A-L受試藥品組;E.1B-H受試藥品組;F.1B-L受試藥品組;G.2A-H受試藥品組;H.2A-L受試藥品組;I.2B-H受試藥品組;J.2B-L受試藥品組;K.3A-H受試藥品組;L.3A-L受試藥品組;M.3B-H受試藥品組;N.3B-L受試藥品組

        圖3家兔給藥后72h肌肉組織病理圖(HE染色,×100)

        A.0.9% sodium chloride injection group;B. water for injection group;C. test drug 1A-H group;D. test drug 1A-L group;E. test drug 1B-H group;F. test drug 1B-L group;G. test drug 2A-H group;H. test drug 2A-L group;I. test drug 2B-H group;J. test drug 2B-L group;K. test drug 3A-H group;L. test drug 3A-L group;M.test drug 3B-H group;N. test drug 3B-L group

        Fig.3Histopathologicalimagesofrabbitsmuscle72hoursafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

        A.2A-H受試藥品組; B.2B-H受試藥品組

        圖4家兔給藥后14d肌肉組織病理圖(HE染色,×100)

        A. test drug 2A-H group;B. test drug 2B-H group

        Fig.4Histopathologicalexaminationofrabbitsmuscle14daysafterintromuscleinjection(HEstaining,×100)

        綜上所述,注射用還原型谷胱甘肽用0.9%氯化鈉注射液做溶媒比注射用水的肌肉刺激反應(yīng)輕,且原研制劑的肌肉刺激最輕。為保障公眾用藥安全和提升我國仿制藥質(zhì)量提供實驗參考依據(jù)。

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