林力，王強(qiáng)，周玉丹，萬(wàn)京樺，周?chē)?guó)祥，徐佳琪，王子濤，肖碩，辛祖超

(1.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院職業(yè)危害識(shí)別與控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、感染免疫與腫瘤微環(huán)境研究所，武漢 430065；2.枝江市人民醫(yī)院，枝江 443200)

天名精為菊科植物天名精CarpesiumabrotanoidesLinnaeus的干燥全草，在湖北廣泛分布，具有清熱化痰、解毒殺蟲(chóng)、破瘀止血的功效，主要用于治療乳蛾喉痹、急慢驚風(fēng)、牙痛、疔瘡腫毒、痔瘺、皮膚癢疹、毒蛇咬傷、蟲(chóng)積、血瘕、吐血、血淋、創(chuàng)傷出血等癥[1]。同時(shí)，天名精也是一味很著名的民族藥，在白族、傈僳族、藏族、土家族和苗族均可藥用[2]。其主要含有倍半萜內(nèi)酯類(lèi)成分，具有抗菌消炎、抗病毒、殺蟲(chóng)、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[3-4]。倍半萜類(lèi)化合物被報(bào)道有抗腫瘤細(xì)胞增殖和抗腫瘤血管新生的功效[4-6]。筆者通過(guò)研究天名精提取物對(duì)小鼠免疫器官、巨噬細(xì)胞吞噬功能、溶血空斑形成情況影響，從免疫學(xué)角度討論了天名精提取物對(duì)機(jī)體免疫功能影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)健康昆明種雄性小白鼠75只，體質(zhì)量(23±2) g，鼠齡4～5周，由武漢科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2012-0067，動(dòng)物合格證號(hào)：42000600025754。小鼠同組同籠飼養(yǎng)，各組基礎(chǔ)日糧相同，自由進(jìn)食，自然晝夜節(jié)律光照。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度(23±1) ℃，相對(duì)濕度(50±10)%，通過(guò)空調(diào)風(fēng)機(jī)與外界實(shí)現(xiàn)通風(fēng)換氣。

1.2藥品與試劑 天名精全草于2017年8月采集于湖北省枝江市，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院楊新洲教授鑒定為菊科植物天名精CarpesiumabrotanoidesLinnaeus，藥材標(biāo)本(編號(hào)SC0811)存于中南民族大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館。天名精提取物的制備：取干燥的天名精粉末500 g，倒入5000 mL圓底燒瓶中，加入2500 mL石油醚，電熱套加熱回流提取3 h，濾過(guò)，濾渣中加入石油醚2500 mL，繼續(xù)加熱回流3 h，濾過(guò)，再重復(fù)前兩次操作，合并3次提取所得濾液，濃縮，得12.5 g石油醚部位。所剩濾渣重復(fù)石油醚部位提取操作，分別加入乙酸乙酯和甲醇，每種溶劑分別提取3次，每次3 h，合并相同的提取濾液，減壓濃縮干得到乙酸乙酯提取物26.7和43.9 g甲醇提取物。乙酸乙酯(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司，批號(hào)：U1265400)；甲醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司，批號(hào)：40030560)；石油醚(60～90 ℃，批號(hào)：816690)；亞甲基藍(lán)溶液(珠海貝索生物技術(shù)公司，批號(hào)：416082)；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州微生物試劑公司，批號(hào)：YJ-135004)；可溶性淀粉(武漢洪山中南化工試劑公司，批號(hào)：2901613)；小牛血清Hanks液(武漢生物制品研究所提供，批號(hào)：KA13136)；補(bǔ)體(武漢生物制品研究所提供，批號(hào)：160102)；綿羊紅細(xì)胞(武漢生物制品研究所提供)；雞紅細(xì)胞混懸液的制備：于無(wú)菌操作下，取雞翅靜脈血置于三角燒瓶中，加入相當(dāng)血液量5倍的Alserver's液，混合均勻后，4 ℃貯存[7]。臨時(shí)用時(shí)吸取紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉溶液洗3次，離心速度為3000 r·min-1，離心半徑為45 cm，離心時(shí)間為10 min，直至紅細(xì)胞壓積穩(wěn)定，然后用0.9%氯化鈉溶液配置成1%雞紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)溶液。

1.3主要儀器 平行蒸發(fā)儀(EZ-2 型，GeneVac公司)；低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；電子天平(上海天平儀器廠，感量：0.01 mg)；Nikon光學(xué)顯微鏡；電熱套(上海坤盟儀器設(shè)備廠)。

1.4動(dòng)物分組及給藥方法 按隨機(jī)數(shù)字表法將75只小鼠隨機(jī)分為5組，每組15只，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了劑量確定，設(shè)立天名精乙酸乙酯提取物小劑量組、甲醇提取物小劑量組、天名精乙酸乙酯提取物大劑量組、甲醇提取物大劑量組和空白對(duì)照組。采用灌胃方式給藥，藥物現(xiàn)配現(xiàn)用?？瞻讓?duì)照組每天給予0.9%氯化鈉溶液，天名精小、大劑量組按50，100 mg·kg-1給藥，每天給藥1次，連續(xù)10 d，每次1 mL。

1.5脾臟質(zhì)量和臟器指數(shù)的測(cè)定 第10天對(duì)小鼠進(jìn)行稱質(zhì)量后，立刻處死小鼠，然后取脾臟于電子天平稱質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)后，計(jì)算脾臟臟器指數(shù)：脾臟臟器指數(shù)=免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量[8]。

1.6吞噬細(xì)胞功能檢測(cè) 第7天將小鼠腹腔注射6%營(yíng)養(yǎng)淀粉肉湯1 mL，刺激小白鼠腹腔產(chǎn)生無(wú)菌性炎癥，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化、聚集。第10天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液配制的1%雞血細(xì)胞1 mL，30 min后注射2 mL小牛血清Hanks液稀釋腹腔液，處死小鼠，立即剖腹，用尖頭吸管沖洗小鼠腹腔液以收集盡可能多的巨噬細(xì)胞[9]。將腹腔液于潔凈試管與1或2滴1%亞甲基藍(lán)溶液混合，均勻涂抹于載玻片上，37 ℃溫箱干燥，生物學(xué)顯微鏡油鏡檢測(cè)，計(jì)算吞噬指數(shù)和吞噬百分比：吞噬率(%)=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞)×100%；吞噬指數(shù)=200個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞。

1.7溶血空斑檢測(cè) 第6天，將5%綿羊紅細(xì)胞0.4 mL(約4×106個(gè))腹腔注射到小鼠體內(nèi)，第10天處死小鼠，剖腹分離脾臟，按文獻(xiàn)[10]法測(cè)定小鼠溶血空斑形成情況。借助放大鏡，進(jìn)行空斑計(jì)數(shù)，計(jì)算1×106個(gè)脾細(xì)胞所含溶血空斑數(shù)。

2 結(jié)果

2.1天名精提取物對(duì)小鼠免疫器官的影響 與空白對(duì)照組比較，天名精乙酸乙酯提取物小、大劑量組與甲醇提取物小、大劑量組小鼠外周免疫器官脾臟質(zhì)量與臟器指數(shù)均明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，天名精乙酸乙酯提取物和甲醇提取物小劑量組效果更佳。見(jiàn)表1。

2.2天名精提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能影響 與空白對(duì)照組比較，天名精乙酸乙酯提取物小、大劑量組與甲醇提取物小、大劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖1。

表15組小鼠脾臟質(zhì)量和臟器指數(shù)比較

組別劑量/(mg·kg-1·d-1)脾臟質(zhì)量/mg臟器指數(shù)空白對(duì)照組117.6±10.893.89±0.13乙酸乙酯 小劑量組50198.6±20.11?15.94±0.62?1 大劑量組100174.8±16.77?15.39±0.47?1甲醇 小劑量組50170.6±10.09?15.30±0.30?1 大劑量組100148.6±12.09?14.46±0.29?1

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

2.3天名精提取物對(duì)小鼠溶血空斑形成影響 與空白對(duì)照組比較，天名精乙酸乙酯提取物小、大劑量組與甲醇提取物小、大劑量組溶血空斑形成數(shù)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明天名精乙酸乙酯、甲醇提取物小、大劑量組均可顯著促進(jìn)小鼠溶血空斑的形成，天名精乙酸乙酯提取物和甲醇提取物小劑量組效果更好。見(jiàn)圖2，表3。

表25組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)比較

組別劑量/(mg·kg-1·d-1)吞噬率/%吞噬指數(shù)空白對(duì)照組35.49±1.640.37±0.06乙酸乙酯 小劑量組5056.60±3.97?11.09±0.07?1 大劑量組10050.80±3.96?11.01±0.05?1甲醇 小劑量組5053.40±3.20?10.68±0.03?1 大劑量組10057.40±1.34?11.01±0.06?1

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

3 討論

天名精全草四季可采摘，廣泛分布于湖北地區(qū)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中天名精被列為上品，入脾、胃、肝三經(jīng)。本課題組制備了天名精的環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲醇3種溶劑提取物。前期，運(yùn)用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)測(cè)試各種提取物對(duì)肺癌、胃癌、宮頸癌、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示天名精的乙酸乙酯、甲醇提取物對(duì)各種腫瘤細(xì)胞株具有廣譜的抗癌效果(在濃度為20 μg·mL-1時(shí)，抑制率>50%)，其中對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7的活性最強(qiáng)(5 μg·mL-1時(shí)，抑制率>95%)，且顯示出良好的濃度-效應(yīng)曲線關(guān)系。天名精提取物和所含的化學(xué)成分已顯示抗菌、殺蟲(chóng)、抗炎、抗腫瘤等活性，但它對(duì)機(jī)體免疫功能的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖耍n題組通過(guò)研究天名精乙酸乙酯、甲醇提取物對(duì)小鼠脾臟質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞功能及溶血空斑形成情況的影響，探討天名精提取物對(duì)小鼠特異性和非特異性免疫功能的作用。

A.空白對(duì)照組；B.乙酸乙酯小劑量組；C乙酸乙酯大劑量組；D.甲醇小劑量組；E.甲醇大劑量組

A.blank control group；B.low-dose ethyl acetate group；C.high-dose ethyl acetate group；D.low-dose methanol group；E.high-dose methanol group

Fig.1Detectiononthefunctionofperitonealmacrophagesinfivegroupsofmice(×1000)

A.空白對(duì)照組；B.乙酸乙酯小劑量組；C乙酸乙酯大劑量組；D.甲醇小劑量組；E.甲醇大劑量組

A.blank control group；B.low-dose ethyl acetate group；C.high-dose ethyl acetate group；D.low-dose methanol group；E.high-dose methanol group

Fig.2Detectionresultsofantibody-formingcellsinvitroinfivegroupsofmousespleens(×100)

表35組小鼠溶血空斑形成情況比較

組別劑量/(mg·kg-1·d-1)溶血空斑形成數(shù)空白對(duì)照組361±11.70乙酸乙酯 小劑量組501368±47.56?1 大劑量組1001280±125.98?1甲醇 小劑量組50498±42.10?1 大劑量組100472±20.40?1

與空白對(duì)照組比較，*1P<0.01

Compared with blank control group,*1P<0.01

脾臟在出生后由造血器官演變?yōu)樽畲蟮耐庵苊庖咂鞴佟Ｆ⑴K是淋巴細(xì)胞定居的重要場(chǎng)所，其中B細(xì)胞占60%，T細(xì)胞占40%，脾臟還負(fù)責(zé)對(duì)血源性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物可促進(jìn)小鼠脾臟生長(zhǎng)、提高脾臟臟器指數(shù)，尤其是小劑量乙酸乙酯提取物、甲醇提取物效果更顯著。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力和消化能力，是參與和促進(jìn)炎癥的重要細(xì)胞，是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬功能對(duì)非特異性免疫起著不可或缺的影響，其檢測(cè)結(jié)果反映非特異性免疫功能強(qiáng)弱；溶血空斑的本質(zhì)是介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞，其檢測(cè)結(jié)果能反映特異性體液免疫功能強(qiáng)弱[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)、吞噬百分率，增強(qiáng)了機(jī)體的非特異性免疫功能，乙酸乙酯提取物以小劑量組效果更優(yōu)，而甲醇提取物以大劑量效果更為顯著。天名精甲醇提取物和乙酸乙酯提取物促進(jìn)了溶血空斑的形成，提高B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，增強(qiáng)機(jī)體的特異性體液免疫功能。天名精對(duì)機(jī)體免疫功能的促進(jìn)作用，小劑量組效果更佳，這主要與中藥的雙向調(diào)節(jié)有關(guān)：在一定濃度內(nèi)中藥天名精可以增強(qiáng)機(jī)體免疫，當(dāng)天名精劑量過(guò)高時(shí)，其增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用就不如小劑量組。結(jié)果提示中藥天名精既可以增強(qiáng)正常的免疫功能，又可以使免疫增強(qiáng)處于一定范圍內(nèi)，防止免疫功能過(guò)于亢進(jìn)[13-14]。

天名精主要化學(xué)成分為萜類(lèi)和黃酮類(lèi)成分，萜類(lèi)成分以單萜和倍半萜骨架為主，主要含有桉葉烷型倍半萜、吉瑪烷型倍半萜、愈創(chuàng)木烷型倍半萜，另含有貝殼杉皖型二萜等結(jié)構(gòu)類(lèi)型；黃酮類(lèi)以黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等骨架為主。倍半萜類(lèi)化合物被報(bào)道過(guò)有抗腫瘤細(xì)胞增殖和抗腫瘤血管新生的功效。目前國(guó)內(nèi)在天名精的開(kāi)放應(yīng)用研究還只是處于起步階段，天名精主要化學(xué)成分開(kāi)發(fā)前景仍在研究階段，是否能成為人體抗腫瘤的化學(xué)新物質(zhì)，亟待進(jìn)一步開(kāi)展研究。