金世光 戴燕 李城 李昌熙 王大新

揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，2疼痛科（江蘇揚(yáng)州225001）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40%～50%［1］，膠質(zhì)瘤臨床治療的點(diǎn)難主要是由于其臨床表現(xiàn)和癥狀、影像學(xué)或形態(tài)學(xué)預(yù)警及其浸潤(rùn)性沒有顯著的特征［2-3］。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，miR?17?5p 在膠質(zhì)瘤中促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。同時(shí)，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了miR?17?5p 靶基因BTG3（B?cell translocation gene 3），而BTG3 參與PI3K?AKT 信號(hào)通路。本研究目的旨在尋找miR?17?5p 作用的直接靶基因BTG3，而BTG3 參與PI3K?AKT 信號(hào)通路，從而闡明miR?17?5p 調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移的分子機(jī)制，并為尋找結(jié)膠質(zhì)瘤的治療性靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 0.25%胰蛋白酶消化液，RNA 酶，10%胎牛血清H?DMEM 培養(yǎng)液，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1、SW1088，pmirGLO 載體，TBST 溶液。

1.2 儀器 qRT?PCR 儀（ABI StepOne Plus），生物安全柜1205A（FORMA），CO2培養(yǎng)箱（FORMA），倒置顯微鏡IX70（OLYMPUS），酶標(biāo)儀（TECAN）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)靶基因BTG3 TargetScan 程序，miRanda 程序和DIANA?microT 程序預(yù)測(cè)miR?17?5p 作用的直接靶基因，將三者中有兩個(gè)或兩個(gè)以上程序同時(shí)預(yù)測(cè)到的基因作為候選的靶基因，結(jié)合miR?17?5p 促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖遷移以及促進(jìn)對(duì)化療抗性的生物學(xué)表型的特點(diǎn)，篩選出候選的靶基因BTG3。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞于24孔板，0.5 mL 無抗生素培養(yǎng)基每孔，第2 天轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到60%～80%每孔。脂質(zhì)體（lipofectamine 3000）轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與細(xì)胞中，混勻。孵箱37 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 裂解細(xì)胞后，12 000 r/min 離心5 min，取上清。按照每個(gè)樣品需100 μL 的量，取適量Renilla 熒光素酶檢測(cè)緩沖液，按照1∶100 加入Renilla 熒光素酶檢測(cè)底物（×100）配制成Renilla 熒光素酶檢測(cè)工作液。每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)，取樣品50 μL，加入100 μL 螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑，以報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照。Renilla 熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲熒光素酶測(cè)定得到的RLU 值除以Renilla 熒光素酶測(cè)定得到的RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度。

1.3.4 qRT?PCR 驗(yàn)證miR?17?5p 與BTG3 關(guān)系U87?2M1 細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染mimics control、miR?17?5p mimics、SW1088 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ASO?NC、miR?17?5p ASO 后，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，利用qRT?PCR 檢測(cè)。

1.3.5 Western Blot 驗(yàn) 證miR?17?5p 與BTG3 關(guān)系 細(xì)胞裂解后分別取20 μL 蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS 變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠取出，轉(zhuǎn)膜1 h，封閉30 min，含一抗的TBST 溶液中過夜。漂洗5 min，共3 次，加入含二抗的TBST（Tris?Buffered Saline and Tween 20）溶液中室溫放置1 h。搖動(dòng)漂洗5 min，共3 次，將膜置于超敏發(fā)光液中2 min，進(jìn)行顯影、定影處理。

1.3.6 利用過表達(dá)和RNAi 的方法，檢測(cè)靶基因表達(dá)水平的變化對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移的影響 將靶基因的過表達(dá)載體pcDNA3/target 轉(zhuǎn)染進(jìn)入SW1088 和U87?2M1 細(xì)胞中，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。以pcDNA3 作為陰性對(duì)照。而將針對(duì)靶基因的siRNA表達(dá)載體pSilencer/sh?target 轉(zhuǎn)染進(jìn)入SW1088 和U87?2M1 細(xì)胞中，pSilencer/control 作為陰性對(duì)照。通過MTT 法和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖遷移能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)靶基因BTG3 利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR?17?5p 的靶基因，結(jié)果miR?17?5p 與靶基因互補(bǔ)結(jié)合的具體位點(diǎn)見圖1。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR?17?5p 與靶基因BTG3 的結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Bioinformatics to test miR?17?5 p and target genes BTG3 binding sites

2.2 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR?17?5p 對(duì)候選靶基因BTG3 的直接調(diào)控作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pmirGLO，過表達(dá)miR?17?5p 以及封閉miR?17?5p，熒光值均沒有變化。轉(zhuǎn)染pmirGLO/BTG3?UTR，過表達(dá)miR?17?5p 后，熒光值降低；miR?17?5p被封閉后，熒光值上升（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染pmirGLO/BTG3?mUTR，過表達(dá)miR?17?5p 以及封閉miR?17?5p，熒光值均沒有變化，見圖2。

圖2 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR?17?5p、BTG3 表達(dá)水平Fig.2 Luciferase detected expression of miR?17?5 p and BTG3

2.3 qRT?PCR 檢測(cè)miR?17?5p、BTG3 表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，U87?2M1 中細(xì)胞中過表達(dá)miR?17?5p 后，miR?17?5p 表達(dá)量升高、BTG3 表達(dá)量降低（P＜0.05）。SW1088 細(xì)胞中miR?17?5p 被封閉后miR?17?5p 表達(dá)量降低、BTG3 表達(dá)量升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 qRT?PCR 檢測(cè)miR?17?5p、BTG3 表達(dá)水平Fig.3 The mRNA levels were detected byqRT?PCR

2.4 Western Blot 驗(yàn)證miR?17?5p 與BTG3 關(guān)系 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR?17?5p 后，BTG3 蛋白含量降低。miR?17?5p 被封閉后，BTG3 蛋白含量升高（P＜0.05），見圖4。

2.5 靶基因BTG3 與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖之間的聯(lián)系 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U87?2M1 細(xì)胞、SW1088 細(xì)胞各組細(xì)胞吸光值結(jié)果顯示，與母細(xì)胞相比，BTG3 沉默的細(xì)胞增殖速率加快，而過表達(dá)BTG3 的細(xì)胞增殖速率減慢，即BTG3 的表達(dá)量與U87?2M1 細(xì)胞的增殖速率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見圖5。

2.6 靶基因BTG3 與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲之間的聯(lián)系 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87?2M1 細(xì)胞、SW1088 細(xì)胞中過表達(dá)BTG3 后穿過上室的細(xì)胞數(shù)量減少，即細(xì)胞侵襲速率減慢，而沉默BTG3 后細(xì)胞侵襲速率加快（P＜0.05），見圖6。

3 討論

圖4 Western Blot 檢測(cè)BTG3 蛋白含量Fig.4 Western Blot testedBTG3 protein level

圖5 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增值情況Fig.5 Cell proliferation detected by MTT

圖6 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力（×200）Fig.6 Transwell tested cell invasion（×200）

惡性膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，無法根治，預(yù)后差，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，易出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移、進(jìn)展迅速、病死率高等特點(diǎn)［5-7］。惡性腫瘤患者中有15%～25%會(huì)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移［8-9］。miRNAs 參與細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞分化等多種生物學(xué)行為，同時(shí)也可參與惡性腫瘤的侵襲、遷移、腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)［10-14］。miR?17?5p 在肝癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌等中的功能已經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道［15-19］。

本研究在前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了miR?17?5p/BTG3在膠質(zhì)瘤的增殖遷移中發(fā)揮著重要作用。為了深入了解miR?17?5p/BTG3 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，通過生物信息學(xué)軟件（TargetScan，miRanda 和DIANA?microT）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR?17?5p 與蛋白BTG3的3′UTR 有結(jié)合位點(diǎn)。然后，通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR?17?5p對(duì)BTG3具有靶定作用。而相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道BTG3 抑制PI3K?AKT 信號(hào)通路的激活，推斷miR?17?5p/BTG3 通過Akt 信號(hào)通路發(fā)揮作用，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。為了驗(yàn)證miR?17?5p/BTG3 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，首先，通過qRT?PCR、Western Blot 驗(yàn)證了miR?17?5p 對(duì)候選靶基因BTG3 的直接調(diào)控，且具有負(fù)調(diào)控作用。然后，通過MTT 法、Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因BTG3 對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靶基因BTG3 可介導(dǎo)miR?17?5p 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲具有調(diào)控作用。不足之處在于實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要以體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，為了進(jìn)一步證明miR?17?5p/BTG3 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的具體作用機(jī)制，下一步工作中在體內(nèi)裸鼠實(shí)驗(yàn)研究miR?17?5p/BTG3 對(duì)膠質(zhì)瘤增殖遷移的影響。因此，本研究理解膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移的分子機(jī)制提供有意義的研究線索，并為尋找膠質(zhì)瘤的治療性靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，這為今后惡性膠質(zhì)瘤基因治療提供新的方向。