張九成 陳衛(wèi)東 鄒 寧

(湖北省腫瘤醫(yī)院腹部放療二病區(qū)，湖北省結(jié)直腸癌臨床醫(yī)學(xué)研究中心，武漢 430079)

結(jié)腸癌是最常見的胃腸道癌癥之一[1]。近些年，隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長及人們生活方式的改變，尤其是飲食結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)腸癌已成為發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的生命與健康。已有研究顯示，結(jié)腸癌的死亡率已躍居全世界癌癥死亡率的第二位，在我國也已達(dá)到第四位[2]。目前，結(jié)直腸癌治療的主要手段有手術(shù)切除、放療、化療，但由于其高發(fā)生率，低治愈率以及較差的預(yù)后，這些治療手段并不是十分理想，所以迫切需要尋找新的治療策略來提高結(jié)腸癌患者的生存率[3]。天然產(chǎn)物作為抗腫瘤藥物的重要來源，具有效果顯著、機(jī)制獨(dú)特、毒副作用小等優(yōu)勢[4]。因此，尋找作用效果好且毒副作用低的抗結(jié)腸癌天然產(chǎn)物具有很好的科學(xué)意義和臨床價值。

甘草在我國藥用歷史悠久，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用。甘草查爾酮A(Licochalcone A，LCA)是從甘草植物中提取的一種黃酮類化合物，主要分布在甘草的根和莖中，具有多種藥理活性，如抗癌、抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等[5]。近年來研究表明LCA具有良好的抗腫瘤活性，對肺癌、胃癌、宮頸癌等均顯示出較好的抑制作用[6]。LCA主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡等途徑來選擇性地抑制多種腫瘤細(xì)胞生長[7]。此外，也有研究表明氧化應(yīng)激在LCA的抗腫瘤活性中發(fā)揮著重要作用[8]。因此，本研究將進(jìn)一步驗(yàn)證LCA良好的抗腫瘤活性，并闡明其具體的分子作用機(jī)制，旨在為結(jié)直腸癌的治療提供新藥物及靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞株：人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株(貨號：ATCCCCL-247)購自美國菌種保藏中心；SW480(貨號：TCHu172)細(xì)胞株購自中科院細(xì)胞庫。

實(shí)驗(yàn)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(貨號：11875101)、胎牛血清(貨號：26140079)、青霉素-鏈霉素(貨號：15140148)購自美國Gibco公司；LCA購自成都瑞芬思生物科技有限公司(純度≥98%，貨號：58749-22-7)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(貨號：M1020-500)購自北京索萊寶科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號：KGA106)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ROS抑制劑NAC(純度>99%，貨號：S0077)、活性氧ROS檢測(DCFH-DA探針法)試劑盒(貨號：S0033)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA法蛋白定量測定試劑盒(貨號：A045-3)及全蛋白提取試劑盒(貨號：W034)購自南京建成生物技術(shù)有限公司；抗ATF6抗體(貨號：24169-1-AP)、抗XBP-1抗體(貨號：25997-1-AP)、抗ATF4抗體(貨號：10835-1-AP)、抗CHOP抗體(貨號：15204-1-AP)、抗Bcl2抗體(貨號：26593-1-AP)、抗Bax抗體(貨號：50599-2-Ig)、抗GAPDH抗體(貨號：10494-1-AP)的兔多克隆一抗以及山羊抗兔IgG二抗(貨號：10285-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Anti-active Caspase3抗體(貨號：ab2302)購自Abcam公司。

1.1.2主要儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)、倒置顯微鏡(尼康，日本)、凝膠處理分析系統(tǒng)(ABI，美國)、低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)、酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國)、FC500型流式細(xì)胞儀(Beckman，美國)等。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和SW480均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的RPMI1640完全培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件：37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)定期換液，待細(xì)胞接近長滿培養(yǎng)瓶底部時，用0.25%的胰酶消化傳代。在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，需對細(xì)胞進(jìn)行同步化培養(yǎng)處理后再進(jìn)行分組及藥物處理。

1.2.2MTT法檢測LCA對HCT116和SW480的增殖抑制作用 取生長處于對數(shù)期的HCT116或SW480細(xì)胞，按照1.0×105ml-1濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為7組，分別為空白對照組、1.0 μmol/L 的LCA藥物組、2.5 μmol/L的LCA藥物組、5 μmol/L的LCA藥物組、10 μmol/L的LCA藥物組、25 μmol/L的LCA藥物組以及50 μmol/L的LCA藥物組，每組設(shè)置3平行復(fù)孔。37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，分別在12 h、24 h和48 h測量各孔細(xì)胞的吸光度(OD)并記錄，計(jì)算各組細(xì)胞在不同生長時間點(diǎn)的生長抑制率，抑制率(%)=(1-藥物組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。以時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制各組細(xì)胞的生長抑制率變化統(tǒng)計(jì)圖，并采用Bliss法計(jì)算LCA在48 h對HCT116和SW480細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)值。

1.2.3Annexin V-FITC/PI雙染檢測各組HCT116細(xì)胞凋亡水平 取生長處于對數(shù)期的HCT116細(xì)胞，按照1.0×105ml-1濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為4組，分別為對照組(含10%FBS的完全培養(yǎng)基)，LCA組(含50 μmol/L的LCA)，N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)組(含5 mmol/L的NAC)以及LCA+NAC組(5 mmol/L的NAC預(yù)先孵育1 h，再加50 μmol/L的LCA)，每組設(shè)置3平行復(fù)孔，用藥后常規(guī)培養(yǎng)24 h。后根據(jù)下列操作檢測各組細(xì)胞凋亡率：①1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞；②加入1 ml預(yù)冷的PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮，1 000 r/min，4°C離心5 min，棄上清；③重復(fù)步驟②兩次；④將細(xì)胞重懸于200 μl的Binding Buffer；加入10 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，4°C避光孵育30 min；⑤加入300 μl Binding Buffer，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；⑥使用CXP分析軟件進(jìn)行分析并記錄結(jié)果。總凋亡率=第二象限B2細(xì)胞占比+第四象限B4細(xì)胞占比。

1.2.4各組HCT116細(xì)胞活性氧(ROS)水平檢測 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，按照1.0×105ml-1濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為4組，分別為對照組(含10%FBS的完全培養(yǎng)基)，LCA組(含50 μmol/L 的LCA)，NAC組(含5 mmol/L的NAC)以及LCA+NAC組(5 mmol/L的NAC預(yù)先孵育1 h，再加50 μmol/L的LCA)，每組設(shè)置3平行復(fù)孔，用藥后常規(guī)培養(yǎng)24 h。后根據(jù)下列操作檢測各組細(xì)胞ROS水平：①1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞；②更換終濃度為10 μmol/L的ROS探針工作液(DCFH-DA)的無血清培養(yǎng)基；③37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光繼續(xù)培養(yǎng)20 min，每隔3～5 min依次輕振蕩混勻；④收集細(xì)胞，PBS洗滌、離心3次；⑤適量PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.5Western blot檢測各組HCT116細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，按照1.0×105ml-1濃度接種于96孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞分為4組，分別為對照組(含10%FBS的完全培養(yǎng)基)，LCA組(含50 μmol/L的LCA)，NAC組(含5 mmol/L的NAC)以及LCA+NAC組(5 mmol/L的NAC預(yù)先孵育1 h，再加 50 μmol/L 的LCA)，每組設(shè)置3個平行復(fù)孔，用藥后常規(guī)培養(yǎng)24 h。后采用全蛋白提取試劑盒對各組HCT116細(xì)胞分別進(jìn)行蛋白提??；用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對所提蛋白進(jìn)行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗(ATF6、XBP-1、ATF4、CHOP、Bcl2、Bax、Cleaved-caspase3和GAPDH)，在4℃下孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，后采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度比分析。

2 結(jié)果

2.1LCA抑制人直腸癌HCT116和SW480細(xì)胞的增殖 MTT檢測結(jié)果顯示(圖1)，LCA呈明顯的時間和濃度依賴性抑制HCT116和SW480細(xì)胞的增殖。與同一時間點(diǎn)1 μmol/L的LCA作用效果比較，細(xì)胞增殖抑制率隨LCA濃度的增加而顯著增高(P<0.05，P<0.01)；其中50 μmol/L的LCA作用細(xì)胞48 h后，HCT116和SW480細(xì)胞的增殖抑制率均高于80%，對細(xì)胞活力抑制效果顯著。根據(jù)Bliss法計(jì)算得出LCA在48 h對HCT116和SW480細(xì)胞抑制濃度的IC50值分別為21.94 μmol/L和29.38 μmol/L，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選擇抑制效果較好的HCT116細(xì)胞為研究對象。

2.2LCA促進(jìn)人直腸癌HCT116細(xì)胞的ROS水平 流式檢測結(jié)果顯示(圖2)，與對照組比較，50 μmol/L 的LCA能顯著增加HCT116細(xì)胞的ROS水平(P<0.01)，而5 mmol/L的NAC處理HCT116細(xì)胞能顯著降低ROS水平(P<0.01)；與5 mmol/L的NAC處理組比較，加入50 μmol/L的LCA共孵育24 h能有效逆轉(zhuǎn)NAC的抑制作用，顯著增加細(xì)胞的ROS水平(P<0.01)。

2.3LCA促進(jìn)人直腸癌HCT116細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示(圖3)，與對照組比較，50 μmol/L的LCA能顯著促進(jìn)HCT116細(xì)胞的凋亡(P<0.01)，而采用5 mmol/L的ROS抑制劑NAC處理HCT116細(xì)胞，細(xì)胞的凋亡率顯著下降(P<0.05)；與5 mmol/L的NAC處理組比較，加入50 μmol/L的LCA共孵育24 h能有效逆轉(zhuǎn)NAC對HCT116細(xì)胞凋亡的抑制作用，顯著增加細(xì)胞的凋亡率(P<0.01)。

圖1 MTT法檢測不同濃度LCA對HCT116和SW480細(xì)胞活性的影響Fig.1 Determining effect of different concentrations of LCA on viability of HCT116 and SW480 cells by MTT assay

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞ROS水平Fig.2 ROS levels in each group of cells were detected by flow cytometry

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rates in each group of cells were detected by flow cytometry

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞ERS及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Determining levels of ERS and apoptosis-related proteins in each group of cells by Western blot

2.4LCA上調(diào)人直腸癌HCT116細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 Western blot檢測結(jié)果顯示(圖4)，與對照組比較，50 μmol/L的LCA處理組細(xì)胞中ERS相關(guān)蛋白ATF6、XBP-1、ATF4和CHOP以及凋亡相關(guān)蛋白中Bax和Cleaved-caspase3的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，而采用5 mmol/L的ROS抑制劑NAC處理HCT116細(xì)胞后，上述指標(biāo)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)；相反地，與對照組比較，50 μmol/L的LCA處理組細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而 5 mmol/L 的NAC處理組Bcl2表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與5 mmol/L的NAC處理組比較，5 mmol/L NAC+50 μmol/L LCA組細(xì)胞中ATF6、XBP-1、ATF4、CHOP、Bax和Cleaved-caspase3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，而Bcl2表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。

3 討論

結(jié)腸癌作為全球發(fā)病率逐年攀升的惡性腫瘤之一，目前的主要治療方法仍然是手術(shù)切除、放化療等，但預(yù)后不良及發(fā)病率高等特點(diǎn)仍使得結(jié)腸癌的治療具有相當(dāng)大的局限性，嚴(yán)重威脅著患者的生命及健康。更徹底地了解結(jié)腸癌的分子病理機(jī)制對于建立新的治療及診斷策略至關(guān)重要。隨著越來越多的中草藥植物的發(fā)現(xiàn)及其天然提取物藥理作用的研究，中草藥植物在抗腫瘤方面的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。黃酮類化合物是一類天然產(chǎn)物，在自然界中普遍存在，具有生理活性廣泛、毒副作用小的特點(diǎn)[9]。近年來，其抗腫瘤作用得到了廣泛的關(guān)注和研究。研究顯示，黃酮類化合物對多種常見癌癥如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、白血病、卵巢癌、胃癌等皆有顯著的防治效果。而其抗腫瘤的機(jī)制主要涉及抗氧化清除氧自由基、促凋亡、阻滯細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤新生血管形成、抑制環(huán)氧合酶2、抑制端粒酶活性等[10]。LCA是一種在甘草中提取的黃酮類有效物質(zhì)，在胃癌的研究中，Xiao等[11]已經(jīng)證明來源于甘草的7種有效成分(甘草酸、甘草次酸、銨鹽、LCA、甘草素、異甘草素以及甘草黃酮)，其中LCA對5種胃癌細(xì)胞株(CES-1、MKN-28、SGC7901、AGS以及MKN-45)抑制作用濃度的IC50值均最小，表明LCA對胃癌細(xì)胞的毒性作用最強(qiáng)，且其主要作用機(jī)制為阻滯G2/M期細(xì)胞和誘導(dǎo)凋亡。而本研究結(jié)果表明，LCA對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和SW480的毒性作用在一定程度上呈明顯的時間與濃度依賴性，且對HCT116的毒性作用強(qiáng)于SW480(48 h的IC50值分別為21.94 μmol/L和29.38 μmol/L)。

越來越多的證據(jù)表明，ROS通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，在抑制癌細(xì)胞增殖方面起著重要作用[12]。低水平的ROS通常能支持細(xì)胞增殖和生存途徑，而一旦ROS水平過高，就會導(dǎo)致有害的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；且在癌細(xì)胞中，癌細(xì)胞會對自身ROS水平進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控，以適應(yīng)自身增殖，而通過自身突變或外界調(diào)控破壞了ROS的平衡，即癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激被調(diào)節(jié)，其增殖能力進(jìn)而會被抑制[13]。因此如何有效抑制癌細(xì)胞ROS水平已成為抗癌的研究重點(diǎn)。研究顯示，ROS途徑是天然黃酮類化合物發(fā)揮抗腫瘤功能的主要途徑之一。例如，黃酮類化合物淫羊藿甙處理的甲狀腺癌B-CPAP細(xì)胞的ROS水平顯著高于未處理的對照組，且導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[14]。在膀胱癌的研究中，Jiang等[15]發(fā)現(xiàn)LCA主要通過增加T24癌細(xì)胞株的ROS水平來抑制其增殖，且經(jīng)LCA處理的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)被破壞，細(xì)胞GSH/GSSG水平呈明顯的濃度依賴性顯著降低。在胃癌的研究中，Hao等[16]同樣發(fā)現(xiàn)LCA能通過增加BGC-823癌細(xì)胞的ROS水平，進(jìn)而激活MAPKs途徑，抑制PI3K/AKT途徑，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。而本研究顯示，LCA同樣能提升HCT116細(xì)胞的ROS水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而采用ROS抑制劑NAC處理后，細(xì)胞的ROS水平及凋亡率顯著下降，證明LCA可通過ROS途徑介導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。

ERS是細(xì)胞啟動的一種自我保護(hù)反應(yīng)機(jī)制，有利于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，但長期持續(xù)的ERS則可以損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，ERS無法恢復(fù)平衡時，細(xì)胞將啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的凋亡程序[17,18]。目前ERS誘導(dǎo)凋亡的途徑主要有CHOP通路、ASK1-JNK通路及Caspase-12通路，其中CHOP是一種凋亡促進(jìn)因子，被認(rèn)為是ERS發(fā)生的標(biāo)志物[19]。而CHOP基因的啟動子中含有ATF6、XBP-1以及ATF4等蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，本研究檢測結(jié)果顯示，LCA能顯著提升CHOP、ATF6、XBP-1以及ATF4的蛋白表達(dá)水平；而ROS抑制劑NAC處理下能顯著逆轉(zhuǎn)這一變化，說明LCA介導(dǎo)的ROS水平變化參與了ERS過程。進(jìn)一步對線粒體凋亡途徑中凋亡相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示，LCA能顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白活化片段Cleaved-caspase3的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，而ROS抑制劑NAC處理下能顯著逆轉(zhuǎn)這一變化，說明LCA介導(dǎo)的ROS水平變化還參與了線粒體凋亡途徑。Kang等[20]在乳腺癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，LCA能顯著提升癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的ROS及線粒體膜電位水平，同時通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，且通過siRNA技術(shù)證明了Sp1蛋白為其靶向作用位點(diǎn)。Tang等[21]在非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LCA不僅能增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP的表達(dá)，還能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬效應(yīng)，且對CHOP進(jìn)行敲降后發(fā)現(xiàn)LCA誘導(dǎo)的癌細(xì)胞活性有所增加，凋亡率和自噬能力均有所下降，提示CHOP蛋白與LCA誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降、凋亡和自噬至關(guān)重要。此外，在膀胱癌中，Yang等[22]的研究表明LCA不僅能增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，進(jìn)而誘導(dǎo)線粒體功能障礙，且ERS通路同樣被證明是LCA誘導(dǎo)T24膀胱癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

綜上所述，LCA以劑量依賴的方式抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的活性；其可能的機(jī)制是通過上調(diào)細(xì)胞ROS水平，進(jìn)而從Bcl2/Bax/Cleaved-caspase3線粒體凋亡和CHOP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激兩條途徑共同誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。因此，LCA有望成為抗結(jié)腸癌的新型治療藥物，但其更全面、深入的抗癌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。