汪宇潔，呂 濤，王孝深

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在多種惡性腫瘤中被激活，并在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、血管生成、腫瘤干細(xì)胞自我更新、輻射敏感性、化療藥物耐藥［1-8］中具有重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）中，抑制Notch信號(hào)通路可降低NPC細(xì)胞增殖能力，增加輻射敏感性［9-11］，相關(guān)microRNA可通過下調(diào)Notch1的表達(dá)降低NPC侵襲遷移能力［12］。Notch信號(hào)通路有4種Notch受體，功能多樣，盡管一些臨床試驗(yàn)已經(jīng)研究了Notch抑制劑對(duì)實(shí)體瘤的作用，然而很少有研究確定對(duì)每個(gè)Notch受體及其相關(guān)基因的影響。既往關(guān)于Notch受體的實(shí)驗(yàn)研究多運(yùn)用RNA干擾技術(shù)或γ-分泌酶抑制劑（γ-secretase inhibitors，GSI），然而兩者均難以實(shí)現(xiàn)Notch信號(hào)途徑中特定基因功能完全喪失。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)核酸酶9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，CRISPR-Cas9）系統(tǒng)作為第三代基因編輯技術(shù)，與以往的基因編輯技術(shù)相比，廉價(jià)、簡單、精確、高效，已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞乃至生物的基因編輯研究［13-16］。用CRISPR-Cas9技術(shù)特異性完全敲除Notch的體外研究尚未見報(bào)道。本研究在人鼻咽癌細(xì)胞CNE2中運(yùn)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)成功敲除Notch1基因，觀察特異性Notch1基因敲除對(duì)CNE2細(xì)胞增殖能力、輻射敏感性、側(cè)群細(xì)胞比例的影響，為進(jìn)一步體外研究Notch1在NPC細(xì)胞中的作用以及與其他信號(hào)通路相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0（Plasmid #62988）質(zhì)粒受贈(zèng)于復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所華國強(qiáng)教授課題組。BbSI內(nèi)切酶、Fast AP購自美國Fermentas公司，瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌Stbl3、DNA Ligation試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。LipofectamineTM2000、嘌呤霉素購自美國Invitrogen公司，DNA Marker、T4PNK購自英國New England Biolabs公司，免疫熒光固定液、熒光二抗、山羊血清購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Notch1抗體購自美國Abcam公司。Hoechst33342、維拉帕米購自Sigma公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE2及人鼻咽正常永生化上皮細(xì)胞NP69為本課題組液氮保存細(xì)胞系，CNE2細(xì)胞系用含10%血清+1%青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，NP69細(xì)胞系用含1%青霉素、鏈霉素的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 基因敲除載體構(gòu)建

根據(jù)美國麻省理工學(xué)院張峰教授實(shí)驗(yàn)室CRISPR-Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)方案［17］，利用在線設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/）設(shè)計(jì)針對(duì)Notch1基因的sgRNA并在上、下游引物添加相應(yīng)的堿基。sgRNA退火形成雙鏈后與經(jīng)過BbsI酶切的PX459質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選、挑克隆、搖菌、提取質(zhì)粒，測序鑒定并選取正確克隆，獲得基因敲除載體。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、藥物篩選、單克隆獲取

將CNE2細(xì)胞鋪種于6孔板，分為未轉(zhuǎn)染的空白組（normal control，NC）、轉(zhuǎn)染PX459空質(zhì)粒對(duì)照組（control，Ctrl）、轉(zhuǎn)染PX459-Notch1-sgRNA的實(shí)驗(yàn)組（Notch1），每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后使用嘌呤霉素3 μg/mL篩選抗性細(xì)胞，將24 h后存活的細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋后種于96孔板中，培養(yǎng)10 d后挑選單克隆細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Notch1蛋白水平

將各個(gè)單克隆細(xì)胞系和對(duì)照組擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白并定量。利用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，采用恒定電流400 mA轉(zhuǎn)膜80 min，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃溫育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗37 ℃溫育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白水平。

1.6 免疫熒光染色觀察Notch1蛋白水平

以5×105個(gè)細(xì)胞爬片，次日免疫染色固定液固定15 min，用0.5%Triton-X100通透15 min，10%山羊血清37 ℃封閉1 h，溫育一抗（兔抗Notch1抗體，免疫熒光抗體稀釋液，1∶200），放置濕盒中4 ℃過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫避光溫育1 h，DAPI稀釋液染核5 min，最后滴加熒光抗淬滅劑，指甲油封片。即刻熒光顯微鏡下觀察。

1.7 CCK-8檢測增殖活力

取對(duì)數(shù)期Parental組、Ctrl組和Notch1-KO組3組細(xì)胞，以500個(gè)細(xì)胞/孔接種于5塊96孔板上，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每24 h進(jìn)行CCK-8檢測，共5 d。檢測前每孔加入10 μL CCK-8，以RPMI-1640培養(yǎng)基設(shè)為空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測450 nm處的吸光度（D）值。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測輻射敏感性

放射線照射使用復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所的137銫放射源裝置，劑量率為0.75 Gy/min。對(duì)數(shù)期Parental組、Ctrl組和Notch1-KO組3組細(xì)胞用胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞梯度稀釋，將不同數(shù)量細(xì)胞接種到6孔板中，細(xì)胞數(shù)分別為200、300、600、1 000和2 500個(gè)，吸收劑量分別為0、2、4、6和8 Gy，照射后12 d棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，甲醇固定，結(jié)晶紫染色。計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞），計(jì)算接種效率（plating efficiency，PE）、存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）。PE（%）=未照射組形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)，SF（%）=（形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）/PE。在Origin 8.0軟件中，使用多靶單擊模型y=1-［1-exp（-x/D0）］n，擬合劑量存活曲線、計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)。

1.9 流式細(xì)胞法檢測側(cè)群細(xì)胞

將對(duì)數(shù)期Parental組、Ctrl組和Notch1-KO組3組細(xì)胞分別制備成1×106個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液；檢測組加Hoechst33342至終濃度5 μg/mL，對(duì)照組加50 μmol/L維拉帕米溫育30 min，再加入Hoechst33342至終濃度5 μg/mL；37 ℃避光溫育90 min，每隔15 min混勻1次；1 500 rpm 4 ℃離心5 min，PBS洗2次，加碘化丙啶至終濃度1 μg/ mL。用Beckman流式細(xì)胞儀檢測：Hoechst 33342 被350 nm紫外光激發(fā)，熒光發(fā)射用405/BP30（Hoechst blue）和570/BP20（Hoechst red）濾光器測定，630/BP30濾光器去除死亡細(xì)胞（被碘化丙啶標(biāo)記）。Gate設(shè)置為側(cè)群細(xì)胞與主群細(xì)胞的交界處，每次以維拉帕米完全抑制這群細(xì)胞為準(zhǔn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS l9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Notch1在鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)量升高

經(jīng)過與內(nèi)參β-actin灰度值對(duì)比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CNE2中Notch1蛋白表達(dá)量比NP69高（P＜0.001，圖1）。

2.2 成功構(gòu)建基因敲除載體

針對(duì)Notch1 CDS區(qū)設(shè)計(jì)了綜合評(píng)分最高的sgRNA（圖2A），Notch1-sgRNA上、下游序列見表1，測序驗(yàn)證sgRNA正確插入到PX459質(zhì)粒中（圖2B），成功構(gòu)建了基因敲除載體。

圖1 CNE2細(xì)胞中Notch1蛋白水平升高Fig.1 Notch1 expression was higher in CNE2 cell line

表1 sgRNA寡核苷酸序列Tab.1 The oligonucleotide sequence of sgRNA

圖2 Notch1 sgRNA設(shè)計(jì)及重組載體測序驗(yàn)證Fig.2 Design of Notch1 sgRNA and verification of recombinant vector via sequencing

2.3 Western blot驗(yàn)證單克隆細(xì)胞中Notch1表達(dá)

圖3A顯示與NC和Ctrl組相比，挑取的8個(gè)CNE2單克隆細(xì)胞株中clone 3和clone 7未檢出Notch1蛋白。將這兩個(gè)克隆細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，再次驗(yàn)證（圖3B）clone 7的Notch1完全無表達(dá)，將clone 7細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.4 免疫熒光驗(yàn)證Notch1無表達(dá)

圖4顯示DAPI染核呈藍(lán)色熒光，Notch1呈綠色熒光，融合圖像顯示Parental、Ctrl細(xì)胞的Notch1位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜區(qū)域，而Notch1-KO細(xì)胞未見Notch1綠色熒光。

2.5 Notch1基因敲除對(duì)CNE2細(xì)胞的增殖抑制作用

圖3 Western blot鑒定Notch1基因敲除細(xì)胞系Fig.3 Identification of Notch1 gene knockout CNE2 cell line by Western blot

圖4 免疫熒光檢測Notch1-KO中無Notch1表達(dá)Fig.4 No Notch1 expression was detected in Notch1-KO by immunofluorescence

圖5 Notch1敲除抑制CNE2細(xì)胞增殖能力Fig.5 Notch1 knockout inhibited proliferation of CNE2 cells

如圖5所示，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加，Parental和Ctrl組的增殖曲線較一致，Notch1-KO組增殖曲線較平緩，經(jīng)單因素方差分析兩兩比較，與Parental、Ctrl組相比，第1～5天Notch1-KO的吸光度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Parental、Ctrl組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 Notch1基因敲除增加CNE2的輻射敏感性

Parental組、Ctrl組和Notch1-KO組3組細(xì)胞經(jīng)2、4、6、8 Gy γ射線照射的存活分?jǐn)?shù)分別為0.715、0.269、0.063、0.008，0.679、0.256、0.056、0.007、0.567、0.153、0.028和0.005?？寺⌒纬汕闆r如圖6A所示，運(yùn)用多靶單擊模型在Origin 8.0軟件中擬合細(xì)胞存活曲線（圖6B），從曲線模型計(jì)算的放射生物學(xué)參數(shù)見表2。結(jié)果顯示，與Parental、Ctrl組相比，Notch1-KO組的D0、Dq、SF2降低，Notch1-KO組的輻射敏感性增加（P＜0.001），Parental、Ctrl組之間輻射敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 細(xì)胞存活曲線放射生物學(xué)參數(shù)Tab.2 Radiobiological parameters of the cell survival curve

圖6 Notch1敲除增加CNE2細(xì)胞輻射敏感性Fig.6 Notch1 knockout increased radiosensitivity of CNE2 cells

2.7 Notch1敲除降低CNE2的側(cè)群細(xì)胞比例

Notch 1-K O 組中側(cè)群細(xì)胞比例為（1.13±0.01）%，較Parental組的（3.81±0.03）%和C t r l 組的（3.7 0±0.0 3）%明顯下降（P＜0.001）。Parental、Ctrl組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。加入維拉帕米后，由于其具有拮抗ABCG2將染料Hoechst33342泵出細(xì)胞外的作用，上述3種細(xì)胞的側(cè)群細(xì)胞比例分別降為0.000%、0.001%和0%（圖7）。

圖7 Notch1敲除降低CNE2細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例Fig.7 Notch1 knockout decreased the side population proportion of CNE2 cells

3 討 論

哺乳動(dòng)物中Notch信號(hào)通路有 4 種同源Notch受體，多種惡性腫瘤中都檢測到Notch受體不同程度和類型的突變，不同受體在不同細(xì)胞中發(fā)揮的功能各異。體外研究中既往多使用RNA干擾技術(shù)、GSI、單克隆抗體抑制Notch信號(hào)通路活性，然而siRNA干擾不能完全喪失受體功能，單克隆抗體目前缺乏針對(duì)Notch4的抗體，GSI為非特異性抑制劑，臨床研究發(fā)現(xiàn)GSI可誘發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如胃腸毒性、肝毒性和腎毒性［18-19］，臨床特異性靶向Notch受體對(duì)提高腫瘤治療效果、減輕不良反應(yīng)尤為重要，因此仍需針對(duì)特異性受體的功能進(jìn)行深入研究。

CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因、位點(diǎn)的特異性突變，從而使特定基因完全喪失生物學(xué)功能。在頭頸部鱗癌中，外顯子組測序顯示Notch1是繼TP53后第二常見的突變基因［20-21］。本研究構(gòu)建了靶向Notch1基因的CRISPR-Cas9基因敲除質(zhì)粒，使鼻咽癌細(xì)胞CNE2中的 Notch1基因完全敲除。Notch1基因敲除后CNE2細(xì)胞的增殖能力下降，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Notch1基因敲除組D0、Dq、SF2均降低，D0為平均致死劑量，即照射后存活37%的細(xì)胞所需要的放射線劑量，D0值越低表示放射敏感性越高，Dq值表示細(xì)胞對(duì)亞致死損傷修復(fù)能力大小，Dq值越小，表明細(xì)胞的亞致死損傷修復(fù)能力越弱，放射線對(duì)細(xì)胞的殺傷力越大。Notch1基因敲除可增加CNE2細(xì)胞的輻射敏感性，與既往受體非特異性研究結(jié)果一致［9，11］。

Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的機(jī)制包括改變腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力，改變腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)，調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響腫瘤血管生成，改變細(xì)胞乏氧狀態(tài)等［22］。腫瘤干細(xì)胞目前被認(rèn)為是導(dǎo)致輻射抵抗、化療藥物耐藥的重要原因，Wang等［23］首次在鼻咽癌細(xì)胞CNE2中分離出側(cè)群細(xì)胞，側(cè)群細(xì)胞被認(rèn)為是一群富含腫瘤干細(xì)胞的群體。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測側(cè)群細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，Notch1基因敲除后SP比例較對(duì)照組下降約71%，既往使用非特異性Notch抑制劑的研究中CNE2細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞比例下降約73%［10］，由此推測Notch1受體在維持CNE2細(xì)胞群體中側(cè)群細(xì)胞比例方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其潛在分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Notch1在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中被激活，并運(yùn)用CRISPR-Cas9技術(shù)特異性敲除Notch1基因進(jìn)一步證實(shí)Notch1基因在CNE2細(xì)胞中的促進(jìn)增殖和輻射抗性作用，Notch1基因缺失所致輻射增敏作用可能與降低干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞比例有關(guān)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解Notch1在鼻咽癌及其他頭頸部鱗癌細(xì)胞中的特異性作用及其機(jī)制。