李 鵬，馬曉瑩，李小嘉，金文琪，丁旭楓，郭修田

1.上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，上海 200070；2.華東理工大學藥學院，上海 200237

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內第二位常見的癌癥類型，也是導致癌癥相關死亡的第四大原因，占全部癌癥病例的9.7%，占全部癌癥死亡人數的8.5%［1］。由于腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSC）群體的存在，大多數癌癥對化療藥物具有抗性，最終導致復發(fā)［2］。CSC是具有自我更新、去分化、致瘤性及固有化學和放射療法抗性的腫瘤細胞亞群［3］。通過結腸癌細胞表面表達的標志分子如CD133、CD44、CD29及乙醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）等從結腸癌中分離得到少部分具有干細胞特性的結腸癌細胞即結腸癌干細胞，以這部分腫瘤干細胞作為腫瘤治療靶點將為腫瘤治療拓展新的方向［4］。

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是在原腸胚形成期間創(chuàng)建中胚層的發(fā)育過程，其中上皮細胞獲得遷移間充質表型［5］，其是腫瘤侵襲和轉移的重要驅動因素，導致許多癌癥患者死亡。有研究者［6］指出特定表面標志物不能作為分選腫瘤干細胞的標志分子，不同文獻中對分選后CSC功能性實驗結果也存在矛盾與差異。有研究者［7］認為CSC存在不同的細胞亞型，且不同CSC亞型對化療抵抗的程度不盡相同。表型可塑性的不同是CSC亞系中治療抵抗不同的關鍵因素。在腫瘤侵襲和轉移中，表型可塑性很重要，同時預示表型可塑性和治療抵抗的CSC亞系可能成為治療干預的重要靶標。本文以CD44和細胞上皮黏附分子/上皮特異性抗原（epithelial cell adhesion molecule/epithelial specific antigen，EpCAM/ESA）為腫瘤干細胞標志物，分選人結腸癌細胞系HCT116移植裸小鼠形成的皮下移植瘤和腹腔轉移瘤中不同分型的結腸癌干細胞亞群（Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P），以分析它們之間多藥耐藥和自我更新能力表型的差異性，從而建立一種新型結腸癌干細胞EMT分層模型，以評價不同活性物質對不同分型的結腸癌干細胞表型的影響。并用當下研究成熟的miR-139-5p及其靶基因TCF4驗證該模型評價EMT的可行性，為臨床研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

SPF級健康雄性BALB/c-nu/nu小鼠10只，4～6周齡，體質量14～18 g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司［生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004］，適應性喂養(yǎng)1周，置于無菌、恒溫、恒濕的環(huán)境中，自由攝取食物和飲水。

1.1.2 試劑

戊巴比妥鈉、DMEM培養(yǎng)基和B27購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司，一抗CD44-FITC、ESA-PE購自美國Thermo Fisher公司，E-cadherin、N-cadherin、vimentin和β-actin購自上海泊灣生物科技有限公司，作為二抗的HRP標記山羊抗兔IgG抗體購自美國Jackson公司，高純度質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。采用美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫搜索目的基因mRNA序列，Primer Premier 5軟件設計PCR引物，引物序列均由華大基因科技有限公司合成。

1.1.3 儀器和設備

電子分析天平購自上海精密科學儀器有限公司（型號：FA2004N），高速冷凍離心機（型號：V14/14R）購自美國Dynamica公司，熒光顯微鏡（型號：Ti-S）購自日本尼康公司，流式細胞儀（型號：FACSCalibur）購自美國BD公司，PCR基因擴增儀（型號：T100TM）、熒光定量PCR儀（型號：CFX96）均購自美國Bio-Rad公司，生物電泳圖像分析系統(tǒng)（型號：FR-980）購自上海復日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 皮下移植瘤和轉移瘤造模及原代細胞提取

將150 μL約1×106個HCT116細胞接種于BALB/c裸小鼠雙側腋下；將100 μL約1×107個HCT116細胞原位接種于BALB/c裸小鼠小腸壁上，并于腹腔內注射1×106個細胞。剪碎組織，切成1 mm3小塊，加入2 000 U/mL膠原酶。在37 ℃水浴中消化30 min，去除消化液，用PBS洗2次，300×g離心8 min，培養(yǎng)基洗1次后，用含5%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基懸浮，并用吸管吹打分散制成細胞懸液，計數。

1.2.2 流式細胞儀分析與分選

收集消化后的含有約1×107個細胞的細胞懸液，300×g離心，2.5%BSA于37 ℃封閉30 min；CD44-FITC抗體和ESA-PE抗體4 ℃同時溫育45 min，PBS洗2遍；用500 μL流式緩沖液重懸細胞上機。分選細胞時注意無菌操作。

1.2.3 MTT法檢測

根據實際需要設計空白組及實驗組的平行孔，對細胞進行特定的前處理，不同濃度奧沙利鉑（oxaliplatin，LOHP）（0、6.25、12.50、50.00和100.00 μg/mL）和氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）（0、12.50、25.00、50.00和200.00 μg/mL）作用細胞48 h。在前處理終止后，用移液器吸去細胞上清液，并加入含有5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基；放置在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱溫育4 h；再次吸走上清液，加入100 μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），震蕩1 min，待甲臜完全溶解后，采用Enspire多功能微孔板檢測系統(tǒng)（美國Perkin Elmer公司）在492和630 nm雙波長處分別檢測其光密度值（D值）；根據以下公式計算細胞存活率：細胞存活率=［D實驗組平均值-D背景組平均值］/［D空白對照組平均值-D背景組平均值］×100%。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

配置反轉錄體系（7 μL ddH2O；1 μL Oligo（dT）18引物；10 μL R-Mix；1 μL E-Mix；1 μL gDNA去除劑）于掌式離心機上快速離心1 min，驅除氣泡；反轉錄RTFQ-PCR程序：2 5 ℃ 5 m i n，4 2 ℃ 3 0 m i n，8 5 ℃5 min。配制20 μL RTFQ-PCR反應體系：10 μL SYBR? Premix EX TaqTMⅡ，2 μL cDNA模板，0.2 μL順義鏈引物（50 μmol/L），0.2 μL反義鏈引物（50 μmol/L），7.6 μL DEPC H2O。反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共循環(huán)40次；65 ℃ 15 s；95 ℃ 10 s。反應結束后通過擴增曲線和融峰曲線對引物特異性進行驗證，每項反應做3個復孔，重復3次，結果取平均值。

1.2.5 Transwell侵襲實驗

將Matrigel基質膠從-20 ℃取出于4 ℃冰箱過夜，在4 ℃條件下將Matrigel基質膠用無血清的DMEM/F12細胞培養(yǎng)基稀釋至300 μL/mL，取100 μL均勻涂抹一層于PET膜上表面，37 ℃放置3 h左右。在下室（即24孔板底部）加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL 5×104個細胞懸液，繼續(xù)在溫箱培養(yǎng)48 h；將其下表面浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定30 min，用0.1%結晶紫染色、鏡檢，并計算PET膜下表面的細胞數，計算中間和四周8個視野，取平均值。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

采用7.5%蛋白質SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，按蛋白定量結果上樣，以70伏電壓使溴酚藍條帶電泳離開濃縮膠，以120 V電壓電泳約1.5 h；之后進行轉膜，使用0.45 μm PVDF膜，采用250 mA電流濕轉2 h，TBST漂洗2 h，5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗［E-cadherin（AB3386）、N-cadherin（CY5015）、vimentin（AB3339）和抗鼠抗體］按1∶1 000比例稀釋，4 ℃過夜溫育、漂洗、二抗封閉、漂洗、顯影，最后采用Image J圖像處理軟件分析條帶。

1.2.7 miR-139-5p過表達載體構建

依據pcDNA3.1+載體和目的片段設計引物正義鏈為5'-CGTGTATTCTACAGTGCACGTGT CTCCAGTGTGGCTCGGAGGCTGGAGACGCG GCCCTGTTGGAGTAACC-3'，反義鏈為5'-TC GAGGTTACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCAG CCTCCGAGCCACACTGGAGACACGTGCAC TGTAGAATACACGGTAC-3'；引物退火：5 μL上游引物，5 μL下游引物，5 μL 10×NEB緩沖液235 μL ddH2O，95 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min。雙酶切載體采用Kpn I和XhoI雙酶切pcDNA3.1+，連接參考普通過表達載體的連接體系，轉化參考普通過表達載體的轉化體系，陽性克隆檢驗采用通用引物進行菌落驗證將陽性克隆送測序公司進行測序。

1.2.8 TCF4（NM_001083962.1）過表達載體構建

依據pEGFP-n1載體和目的片段設計引物。正義鏈為5'-CCGCTCGAGGCCACCATGCATCA CCAACAGCGAATGGCTG-3'，反義鏈為5'-CC GGAATTCGCATCTGTCCCATGTGATTCGATG CG-3'。擴增TCF4片段，切膠回收，DNA純化（StarPrep快速DNA膠回收試劑盒）；對載體和純化片段進行EcoRI和XhoI雙酶切；16 ℃過夜酶連，酶連試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；將酶連產物進行重組反應，轉化，涂板，長出單克隆點；對克隆進行挑點搖菌擴增，提取質粒后送測序。

1.2.9 TCF4敲低載體構建

根據Sigma-Aldrich網站（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）給出的shRNA序列和pSilencer2.1_U6載體說明書設計引物。正義鏈為5'-GATCCGTCATTGGACCTTCTCATAACTC AAGAGATTATGAGAAGGTCCAATGATTTTTT GGAAA-3'，反義鏈為5'-AGCTTTTCCAAAAA ATCATTGGACCTTCTCATAATCTCTTGAGTTA TGAGAAGGTCCAATGACG-3'。兩條引物退火［寡核苷酸退火緩沖液（5×），上海碧云天生物技術有限公司］，載體HindⅢ和BamHI雙酶切；16 ℃過夜酶連［寶生物工程（大連）有限公司］，將酶連產物進行重組反應、轉化、涂板、長出單克隆點；對克隆進行挑點搖菌擴增，提取質粒后送測序。

1.2.10 統(tǒng)計學處理

使用Graphpad Prism 5.0進行統(tǒng)計學分析后作圖，實驗數據統(tǒng)一以x±s的形式表示，Student's t檢驗評價各受試組與對照組之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 流式細胞術分析結直腸癌細胞株CD44+/ESA+細胞比例

透明質酸受體CD44是一類重要的黏附分子，與腫瘤轉移密切相關。EpCAM/ESA是一種單次跨膜蛋白，于1979年由Herlyn等在結腸癌中發(fā)現(xiàn)，被認為是人類結腸癌組織主要的腫瘤相關抗原，可作為結腸癌靶向給藥的潛在靶點。我們選取了5種常用的人結直腸癌細胞系HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8。采用流式細胞術分別檢測了這些細胞的CD44-FITC和ESA-PE抗體染色的雙陽性比率。HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8中ESA+CD44+百分比分別為29.900%、0.410%、24.100%、0.135%和0.970%（圖1）。我們最終選取了HCT116細胞作為后續(xù)動物模型和細胞分選的材料。

圖1 流式細胞儀分析結直腸癌細胞株HT-29、Caco-2、HCT116、LOVO和HCT8細胞表面CD44-FITC和ESA-PE雙陽性亞群情況Fig.1 Flow cytometry was used to analyze the expressions of CD44-FITC and ESA-PE double positive subpopulation on the surface of colorectal cancer cell lines HT-29, Caco-2, HCT116, LOVO and HCT8

2.2 構建HCT116 BALB/c裸小鼠皮下移植瘤和轉移模型

按之前所示方法構建小鼠皮下瘤和轉移瘤模型。皮下接種細胞5 d即肉眼可見突起的結節(jié)。4周后，皮下瘤生長至100 mm3，無菌環(huán)境下，提取皮下瘤原代細胞。打開小鼠腹腔，觀察到小腸壁上肉眼可見瘤塊，腹膜上形成轉移結節(jié)，仔細剝離腹膜上5個白色米粒大小的轉移結節(jié)，提取并收集轉移灶細胞，于37 ℃、CO2體積分數為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，連續(xù)傳代（圖2）。

2.3 流式細胞術分選

以CD44和ESA為結腸癌干細胞標志物，采用流式細胞儀分選1×107個臺盼藍染色鑒定細胞活力＞95%皮下移植瘤原代細胞中CD44+ESA+、CD44+ESA-細胞亞群和轉移瘤中CD44+ESA+、CD44+ESA-細胞亞群，分別命名為Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P。親本株HCT116作為后續(xù)實驗的陰性對照。Epi-S的CD44+ESA+占90.3%，Epi-P的CD44+ESA-占90.4%，pEMT-S的CD44+ESA+占97.8%，以及pEMT-P的CD44+ESA-占78.1%。結果見圖3。分選后的各分型細胞培養(yǎng)在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中：DMEM/F12 5 mL、20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、5 μg/mL胰島素、0.4% BSA、2%B27和100 U/mL P/S）。

2.4 驗證分選后不同細胞亞群的多藥耐藥性、克隆形成能力

不同的CSC分型對細胞侵襲轉移，體內癌癥轉移和化療抵抗的程度不盡相同。我們采用MTT和克隆形成實驗驗證不同細胞亞群的多藥耐藥性和克隆形成能力，分選后的細胞亞群在干細胞培養(yǎng)基中適應性培養(yǎng)1周后，傳代一次，用于功能鑒定實驗的初始細胞濃度為1×106個/mL（圖4）。相較于HCT116親本細胞株，Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P共4種CSC分型均對LOHP和5-FU產生了不同程度的抗性。其中，親本細胞株對LOHP和5-FU的IC50值分別為11.89和3.09 μg/mL，Epi-S為37.41和27.29 μg/mL，Epi-P為15.67和14.97 μg/mL，pEMT-S為34.95和26.26 μg/mL，pEMT-P為16.15和45.70 μg/mL。在2% FBS血清中培養(yǎng)7 d后，各組培養(yǎng)物于4%多聚甲醛中固定，用0.1%結晶紫染色。結果發(fā)現(xiàn)，Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P共4種CSC分型與親本株相比，克隆形成能力均增強，這可能與分選后的細胞獲得了干細胞的自我更新能力相關。

2.5 構建miR-139-5p過表達、TCF4過表達/敲低質粒

圖2 HCT116細胞分別接種于BALB/c裸小鼠腋下和小腸壁成瘤情況檢測Fig.2 Tumor formation of HCT116 cells inoculated into the axilla and small intestinal wall of BALB/c nude mice

圖3 以CD44和ESA為結腸癌干細胞標志物Fig.3 CD44 and ESA were used as markers of colon cancer stem cells

圖4 MTT檢測HCT116親本株Fig.4 MTT assay was used to detect HCT116 parental strains

按照實驗方法中的步驟構建 hsa-miRNA-139-5p過表達質粒，用NCBI blast序列，100%匹配。采用脂質體法瞬時轉染親本株HCT116，于48 h后采用RTFQ-PCR驗證miR-139-5p過表達效率（P＜0.01）。利用開放在線工具Ambion（http://www.invitrogen.com）、siDRM（sidrm.biolead.org）和Promega （http://www.promega.com）設計靶序列。兩條正反義鏈分別包括了BamHI和HindⅢ黏性末端、shRNA兩條互補鏈和9-mer的loop結構。兩條鏈退火雜交后，2%瓊脂糖凝膠電泳驗證、轉化、涂板、挑點、搖菌、提質粒后，送測序。用NCBI blast序列，100%匹配。瞬時轉染親本株HCT116，48 h后采用RTFQ-PCR和Western blot驗證TCF4敲低效率（P＜0.001）。TCF4過表達序列包含整個CDS區(qū)，采用RTFQ-PCR和Western blot驗證TCF4過表達效率（P＜0.05，圖5）。

2.6 采用RTFQ-PCR檢測不同分選后細胞中干性相關轉錄因子SOX2、OCT4和EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達情況

采用RTFQ-PCR檢測干性相關轉錄因子SOX2、OCT4和EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin在HCT116親本細胞株、Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P中的表達情況，以分析它們之間自我更新能力表型以及EMT表型的差異。其中，干性相關轉錄因子OCT4和SOX2在4種CSC分型中表達均升高，與親本株相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。OCT4在塑性EMT（pEMT-P）的亞系中較具有穩(wěn)定EMT表型（pEMT-S）的亞系中表達升高（P＜0.05）。上皮相關標志物E-cadherin，間充質相關標志物N-cadherin和vimentin在4種CSC分型中表達均升高，與親本株相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。分選后的細胞，E-cadherin轉錄因子在mRNA水平被過度激活。其中，經歷塑性EMT的亞系（ESA-）中E-cadherin表達水平要低于具有穩(wěn)定上皮表型的亞系（ESA+）（P＜0.01）。N-cadherin和vimentin在塑性EMT（pEMT-P）的亞系中較具有穩(wěn)定EMT表型（pEMT-S）的亞系表達升高（P＜0.05，圖6）。

2.7 Transwell驗證miR-139-5p、TCF4對不同亞型細胞侵襲能力的影響

圖5 構建miR-139-5p過表達、TCF4敲低/過表達質粒Fig.5 The miR-139-5p overexpression and TCF4 knockdown/overexpression plasmids were constructed and sequenced respectively

圖6 RTFQ-PCR檢測在HCT116親本株（Parental）、Epi-S、Epi-P、pEMT-S和pEMT-P中干性相關轉錄因子SOX2、OCT4和EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表達情況Fig.6 RTFQ-PCR was used to detect stem cell transcription factor SOX2, OCT4 and EMT-related proteins in HCT116 parental strains(Parental), Epi-S, Epi-P, pEMT-S and pEMT-P

以CD44和ESA為標志物分選并鑒定了結腸癌干細胞4種不同的分型后，我們?yōu)榱嗽u價這種結腸癌干細胞上皮-間質轉化分層模型研究的可行性，以先前在結腸癌細胞以及CD133+/CD44+結腸癌干細胞中研究過的miR-139-5p以及其靶蛋白TCF4作為參照品，Transwell分別檢測miR-139-5p過表達，TCF4敲低對Epi-P和pEMT-P CSCs分型以及TCF4過表達對Epi-S和pEMT-S CSCs分型侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)過表達miR-139-5p或敲低TCF4均能抑制Epi-P和pEMT-P 結腸癌干細胞亞型的侵襲能力（P＜0.01）。在表型穩(wěn)定未經歷EMT的上皮亞系Epi-S中，過表達TCF4，能夠顯著促進其侵襲能力（P＜0.01，圖7）。

2.8 Western blot檢測miR-139-5p、TCF4對不同亞型細胞中E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白水平的影響

在Epi-P和pEMT-P中過表達miR-139-5p或敲低TCF4；在Epi-S和pEMT-S中過表達TCF4。Western blot檢測EMT標志分子E-cadherin、N-cadherin和vimentin，驗證是否促進分型間的轉化。實驗結果表明，Epi-P和pEMT-P中過表達miR-139-5p和敲低TCF4，上皮標志物E-cadherin水平增加，間充質標志物N-cadherin和vimentin水平下降。Epi-S和pEMT-S中過表達TCF4，上皮標志物E-cadherin水平下降（pEMT-S變化不明顯），間充質標志物N-cadherin和vimentin增加（圖8）。

圖7 Transwell實驗檢測miR-139-5p、TCF4對細胞侵襲能力的影響Fig.7 The effect on invasion ability of miR-139-5p and TCF4 detected by Transwell assay

圖8 Western blot檢測EMT標志物的蛋白水平Fig.8 Western blot was used to detect EMT marker proteins

3 討 論

通常，CSC被定義為腫瘤細胞亞群，其具有腫瘤起始能力和重建原始腫瘤典型細胞異質性的能力［8］。我們認為結腸癌干細胞包括兩種具有不同表型的CSC，一種類似于正常上皮干細胞，另一種類似于Mani等［9］描述的EMT CSC。這與文獻報道的“遷移性癌干細胞”概念非常吻合［10］，其中惡性干細胞獲得兩種表型，一種與生長有關，另一種與遷移有關，其特征是“上皮細胞向間充質轉化相關基因的瞬時表達，可通過MET逆轉，導致上皮細胞再分化”，從而實現(xiàn)在轉移部位形成繼發(fā)性腫瘤。

CSC通常和成體干細胞（somatic stem cells SSC）共享表面標志物。然而，輕微的表面抗原差異以及信號轉導通路和代謝改變可以區(qū)分CSC和SSC［11］。在這方面，許多CSC標志物包括CD44、CD133、受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、ALDH、EpCAM/ESA和ATP結合盒亞家族G成員2（ATP-binding cassette, subfamily G, member 2，ABCG2）是用于限定實體瘤中CSC群體的有用靶分子［12］。其中CD44是一類重要的黏附分子，與結腸癌肝轉移密切相關，其在結腸癌干細胞中普遍高表達，其與低表達的上皮標志物ESA一起提示了CD44high/ESAlow這一亞群與EMT CSC亞群相對應。

本文中我們提出了一種結腸癌干細胞EMT分層模型，它定義了腫瘤內的分層細胞關系，可充分體現(xiàn)腫瘤細胞的表型可塑性。在該模型中，CD44+ESA+是非遷移性的結腸癌干細胞亞型（non-EMT CSC），CD44+ESA-是遷移性的EMT CSC。而CD44+ESA+及CD44+ESA-的來源又分為皮下移植瘤以及小腸原位接種后的轉移瘤。這四種亞型分別為：① 表型穩(wěn)定的上皮亞系，其具有有限的經歷EMT的能力（Epi-S）；② 具有增強的經歷EMT的能力的塑性上皮亞系（Epi-P）；③ 穩(wěn)定的后EMT亞系不能經歷MET（pEMT-S）；④ 可以經歷MET的塑性后EMT亞系（pEMT-P）［7］。4種亞型均較親本細胞株，表現(xiàn)出增強的多藥耐藥性和克隆形成能力，提示它們均獲得結腸癌干細胞的干性特征，但由于EMT表型的差別，導致其CSC自我更新能力不盡相同。這種模型可以評價不同活性藥物對結腸癌干細胞中不同細胞亞型之間表型轉化的影響。為了驗證這一模型的實用性，我們選取了課題組之前研究過的抑癌基因miR-139-5p以及其靶蛋白TCF4。miR-139-5p抑制結腸癌細胞轉移。TCF4（又名E2-2）是基本螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子，在決定各種組織細胞命運和分化中起關鍵作用［13］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)其在CD133+/CD44+結腸癌干細胞中受到miR-139-5p靶向抑制。TCF4是Snail1、Snail2和E47的直接或間接下游靶點，誘導E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的抑制和間質標志物的表達。我們發(fā)現(xiàn)在能夠經歷EMT的Epi-P和pEMT-P CSCs分型中過表達miR-139-5p和敲低TCF4均能抑制結腸癌干細胞亞型的侵襲能力，同時上皮標志物E-cadherin表達增加，間充質標志物N-cadherin和vimentin表達下降。而在穩(wěn)定表達上皮特質的Epi-S和pEMT-S中過表達TCF4顯著促進細胞侵襲能力，間充質標志物N-cadherin和vimentin表達增加。

綜上，本研究首次建立了以CD44和ESA為標志物的結腸癌干細胞EMT分層模型，可用于評價不同生物活性物質對結腸癌干細胞EMT的影響。