申永瑞， 宋 燁， 向君亮， 王佳琦， 劉 權(quán)， 殷奎德

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

馬鈴薯瘡痂病是馬鈴薯的常見病害，不僅嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)，還會導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量的下降，造成經(jīng)濟損失[1-2]。馬鈴薯瘡痂病是由瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabies)引起的一種危害馬鈴薯塊莖的病害，主要通過土壤進(jìn)行病菌的傳播，從皮孔或傷口侵入后染病，其發(fā)病癥狀一般為薯塊表面產(chǎn)生凸起或凹陷的病斑[3]。在我國，馬鈴薯瘡痂病在甘肅、黑龍江、四川和云南等馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)生十分廣泛[4-7]。由于馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病日趨頻繁，但傳統(tǒng)化學(xué)防治會造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，因此對馬鈴薯瘡痂病進(jìn)行生物防治顯得尤為重要。

芽孢桿菌是一種理想的生防微生物，對高溫、紫外線和酸堿環(huán)境均具有一定的耐受性，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)如多肽、多糖、次生代謝物、抗菌蛋白等[8-9]，對病害起到良好的防治效果。目前，已出現(xiàn)多種芽孢桿菌與馬鈴薯瘡痂病生物防治相關(guān)的報道[10-12]，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)等。但是，由于菌株在施加土壤后抑菌活性的發(fā)揮受到嚴(yán)重限制，目前并未見有芽孢桿菌在田間大規(guī)模的應(yīng)用。因此，如何提高芽孢桿菌的抑菌活性有待進(jìn)一步研究。現(xiàn)階段，芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化是提高芽孢桿菌抑菌活性的主要途徑。響應(yīng)面法(Response Surface Methodology，RSM)是一種生物過程優(yōu)化的統(tǒng)計學(xué)試驗設(shè)計方法，對影響生物過程的因子及其交互作用進(jìn)行評價，確定最佳水平范圍[13]。此外由于其具有試驗次數(shù)少、試驗周期短、精密度高、求得回歸方程精度高、預(yù)測性能好，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點，目前已得到廣泛應(yīng)用[14-17]。

筆者等前期分離得到一株對瘡痂鏈霉菌具有顯著拮抗作用的生防菌Bacillussp.BU108，并采用單因素多水平試驗設(shè)計方法對其碳源、氮源、碳源/氮源(質(zhì)量比)、無機離子、培養(yǎng)時間等發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化[18]。為進(jìn)一步提高BU108對瘡痂鏈霉菌的抑制效果，通過Plackett-Burman試驗、Box-Benhnken試驗和響應(yīng)面分析等數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法對BU108的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在確定BU108的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，提高BU108對瘡痂鏈霉菌的抑菌活性，為馬鈴薯瘡痂病的生物防治提供材料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為Bacillussp.BU108，病原菌為瘡痂鏈霉菌，均由筆者所在的試驗室分離保存。

瘡痂鏈霉菌培養(yǎng)基為YME固體培養(yǎng)基：麥芽糖 1%，酵母浸粉 0.4%，葡萄糖 0.4%，瓊脂 2%，pH 7.2。

Bacillussp.BU108培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基(基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基)為NaCl 1%，蛋白胨 1%，酵母浸粉 0.5%，pH 7.5；初始優(yōu)化培養(yǎng)基為葡萄糖(碳源)，酵母浸粉(氮源)，碳源/氮源(質(zhì)量比)1∶2，NaCl 0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 8[18]。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)條件

將Bacillussp.BU108接種在5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，175 r/min過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)液按照1∶100比例接種在裝有300 mL發(fā)酵培養(yǎng)條件的500 mL錐形瓶中，于28℃，170 r/min培養(yǎng)22 h。采用冷凍離心法(12 000 g，離心15 min)獲得上清培養(yǎng)液。

1.3 抑菌活性檢測

采用牛津杯法進(jìn)行抑菌活性的測定。在無菌平皿中倒入20 mL已融化的YME固體培養(yǎng)基，凝固后，加入150 μL病原菌懸液，使用無菌涂布器進(jìn)行涂布至干燥，制成病原菌培養(yǎng)基。將已滅菌的牛津杯平整地擺放在培養(yǎng)基上，向牛津杯中加入100 μL芽孢桿菌上清液，隨后將病原菌培養(yǎng)基放置在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以空白發(fā)酵液培養(yǎng)基為對照，測量抑菌圈半徑，重復(fù)5次，計算平均值進(jìn)行抑菌活性的測定。

1.4 響應(yīng)面試驗

1.4.1 Plackett-Burman試驗 以抑菌圈半徑為響應(yīng)變量，在單因素試驗的基礎(chǔ)上[18]選取氮源(酵母浸粉)、碳源(葡萄糖)、培養(yǎng)溫度、pH、碳源/氮源(質(zhì)量比)、培養(yǎng)時間、無機離子(NaCl)共7個因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗。通過Minitab 15.0設(shè)計Plackett-Burman試驗方案(表1)，確定試驗次數(shù)12次，6次重復(fù)，選取1和-1水平對各因素進(jìn)行編碼，然后根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計方案進(jìn)行抑菌活性試驗，確定對Bacillussp.BU108抑菌效果有較大影響的因子。

1.4.2 Box-Benhnken試驗 根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果篩選得到主要影響因子，在確定其他因素均在最優(yōu)水平的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗設(shè)計Box-Benhnken試驗對主要因素進(jìn)行優(yōu)化，建立主要影響因素與抑菌圈半徑二次多項數(shù)學(xué)模型，找出抑菌活性的最佳值。通過Design Expert 8.0設(shè)計Box-Benhnken試驗方案，并進(jìn)行6次重復(fù)試驗以便于保證試驗的準(zhǔn)確性。以Bacillussp.BU108 的抑菌圈半徑為響應(yīng)值，經(jīng)回歸分析后，確定函數(shù)方程式，并且根據(jù) Box-Benhnken 試驗設(shè)計結(jié)果進(jìn)行抑菌試驗，對試驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行顯著性分析，進(jìn)一步優(yōu)化主要影響因素，確定Bacillussp.BU108發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計方案Table 1 Design scheme of Plackett Burman experiment

1.4.3 發(fā)酵條件驗證 利用響應(yīng)面軟件(Design Expert)分析Bacillussp.BU108的最佳培養(yǎng)條件，將響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)條件與初始發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵試驗，重復(fù)6次，隨后采用牛津杯法對菌株進(jìn)行抑菌活性檢測，并將實際檢測得到的抑菌圈半徑與理論值進(jìn)行比較，從而確定模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響B(tài)U108抑菌活性的主要因子

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果(圖1)可知，采用7號方案進(jìn)行PB試驗得到的培養(yǎng)條件最佳，抑菌圈半徑最大(12.2 mm)，抑菌效果最顯著。通過SPSS 18.0對Plackett-Burman試驗的7個因素進(jìn)行主效應(yīng)分析結(jié)果(表2)表明，初始優(yōu)化培養(yǎng)基的3個成分可信度均大于95%，P值越小，系數(shù)越顯著。以抑菌圈半徑為響應(yīng)變量確定其影響因素從大到小分別為無機離子(NaCl)、培養(yǎng)時間、碳源/氮源(質(zhì)量比)、氮源、碳源、pH、培養(yǎng)溫度，從而確定其主要影響因素為無機離子(NaCl)、培養(yǎng)時間和碳源/氮源(質(zhì)量比)。

圖1 Bacillus sp.BU108菌株對瘡痂鏈霉菌的抑菌圈半徑Fig.1 Radius of inhibition zone of B. subtilis BU108 for Inhibiting S. scabies

表2 7個試驗因子的主效應(yīng)Table 2 Main effect of seven testing factors

2.2 主要影響因素的優(yōu)化

為了進(jìn)一步優(yōu)化Bacillussp.BU108的培養(yǎng)條件，根據(jù)Plackett-Burman 試驗結(jié)果對3個主要影響因素即無機離子(NaCl)、培養(yǎng)時間和碳源/氮源(質(zhì)量比)進(jìn)行深入優(yōu)化，通過Design Expert 軟件進(jìn)行Box-Behnken(響應(yīng)面)設(shè)計并將每個因素以-1、0 、1 進(jìn)行3個水平編碼(表3)。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計共進(jìn)行17次試驗(表4)，并進(jìn)行 6次重復(fù)試驗，通過牛津杯法檢測各試驗組發(fā)酵液的抑菌活性，隨后通過Design Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建得到二次響應(yīng)面回歸方程:

式中，x1為碳源/氮源(質(zhì)量比)，x2為培養(yǎng)時間，x3為無機離子(NaCl)，y為抑菌圈半徑。

表3 主因素水平設(shè)計的因子及水平Table 3 Factors and Level of main factor level design

表4 主因素正交試驗及其抑菌圈半徑Table 4 Radius of inhibition zone of main factor level design

2.3 BU108的最佳培養(yǎng)條件

對二次響應(yīng)面回歸方程的分析結(jié)果(表5)可知，二次響應(yīng)面回歸方方程的F值為5.15，且P大于F值的概率為0.021，因此得到的方程具有顯著性。進(jìn)一步確定菌株BU108的最佳培養(yǎng)條件：碳源為葡萄糖，氮源為酵母浸粉，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.68%，KH2PO40.05%，碳源/氮源(質(zhì)量比)1∶2.46，初始 pH 8.0，培養(yǎng)時間為22.56 h。模型可信度分析的回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=86.87%，說明86.87%所得的抑菌圈半徑的變化可以用此方程來解釋，方程擬合效果較好；CV值為13.59%，表明方程可信度較高，試驗操作可靠，可以用于下一步試驗。

2.4 主要影響因子的相關(guān)性

等高線的形狀越接近橢圓形，則兩因素之間的交互作用越顯著。響應(yīng)面圖能夠直觀地反映兩因子交互作用對響應(yīng)變量產(chǎn)生的影響，每個響應(yīng)面分別表示2個獨立變量間存在的相互作用，同時其他變量保持在最佳水平。從圖2可知，培養(yǎng)基中碳源/氮源、培養(yǎng)時間和無機離子兩兩之間存在交互作用，其中碳源/氮源與培養(yǎng)時間之間的交互作用最為顯著。此外隨著對培養(yǎng)基中3個主要成分的優(yōu)化，響應(yīng)變量(抑菌圈半徑)逐漸增大，達(dá)到穩(wěn)定點后，抑菌圈半徑不再變化，進(jìn)一步證明了培養(yǎng)基中3個主要成分與Bacillussp.BU108的抑菌活性具有密切的相關(guān)性。

表5 回歸方程分析結(jié)果Table 5 Results of regression equation analysis

2.5 發(fā)酵條件的驗證

發(fā)酵條件的驗證結(jié)果表明，初始發(fā)酵條件得到的抑菌圈半徑為9.2 mm，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的抑菌圈半徑為12.7 mm，抑菌率提高28%；此外，優(yōu)化后抑菌圈半徑的實際值與理論值(12.9 mm)相比，其相對誤差僅為0.023，進(jìn)一步證明響應(yīng)面法優(yōu)化得到Bacillussp.BU108的發(fā)酵培養(yǎng)條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，證實了模型的有效性。

3 結(jié)論與討論

研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗方法，以抑菌圈半徑為響應(yīng)變量，對各個因素的效應(yīng)進(jìn)行評價，確定3個主要的影響因素分別為碳源/氮源(質(zhì)量比)、培養(yǎng)時間和無機離子(NaCl)，其他因素分別固定在各自的最優(yōu)水平上。隨后通過Box-Benhnken試驗對 3個主要因素進(jìn)一步優(yōu)化，并建立二次響應(yīng)面回歸模型，確定最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果顯示，Bacillussp.BU108的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為碳源/氮源1∶2.46，NaCl 0.68%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.05%，初始 pH 8，培養(yǎng)時間22.56 h。在優(yōu)化條件下經(jīng)搖瓶培養(yǎng)試驗驗證，理論值與驗證試驗的平均值接近，與初始培養(yǎng)條件相比，抑菌率提高28%，抑菌圈半徑達(dá)12.7 mm。因此，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的Bacillussp.BU108的發(fā)酵條件準(zhǔn)確可靠，具有實際應(yīng)用價值。

芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化主要采用正交試驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計等方法，盡管正交試驗?zāi)軌驅(qū)甑呐囵B(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，但是在試驗過程中往往需要耗費大量的時間和精力。在單因素試驗的基礎(chǔ)上首先采用響應(yīng)面設(shè)計方法中的Plackett-Burman試驗篩選得到主要影響因素[19]，隨后通過Plackett-Burman試驗對主因素進(jìn)行優(yōu)化，從而得到響應(yīng)方程，此方法試驗次數(shù)更少且結(jié)果更加準(zhǔn)確，有利于確定Bacillussp.BU108的最佳發(fā)酵條件，為馬鈴薯瘡痂病的生物防治和微生物殺菌劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

試驗采用響應(yīng)面分析法對Bacillussp.BU108的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化并確定了最佳發(fā)酵條件，后期研究將在試驗的基礎(chǔ)上對Bacillussp.BU108抗菌物的表達(dá)量及純化工藝進(jìn)行深入優(yōu)化，進(jìn)而提高其發(fā)酵效率和抑菌活性。研究結(jié)果為Bacillussp.BU108的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的參考價值。