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(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039;2.宜賓學院生命科學與食品工程學院,四川宜賓 644000)

葛根是豆科葛屬植物的根,其營養(yǎng)豐富,富含淀粉、氨基酸、膳食纖維,且含葛根素、大豆苷、大豆苷元等黃酮類物質,具有心血管保護[1-2]、神經保護[2]、預防骨質疏松[3]、降低膽固醇[4]、肝腎保護[5-6]等藥理作用和保健功能。目前,對葛根綜合利用主要集中在葛根黃酮成分藥理作用研究[1-3]、葛根酵素[7]、葛根復合飲料[8]、葛根全粉[9]等方面。葛根酒研發(fā)多以與糯米等其他原料混合制得的葛根黃酒,單獨以葛根為原料發(fā)酵低度酒的研究相對較少。

如張麗杰等[10]利用響應面法對α-淀粉酶、糖化酶、酵母添加量三個因素進行了優(yōu)化,得到了酒精體積分數(shù)6.37%、總黃酮溶出量28.66 mg/mL的葛根酒;孫國術等[11]采用微波進行葛根糊化處理,研究α-淀粉酶、糖化酶、酵母添加量以及發(fā)酵時間對酒精度、葛根素含量和感官品質的影響,以響應面法確定制備工藝,獲得酒精體積分數(shù)為7.47%、葛根素含量為30.45 mg/100 g的葛根酒;蔣鵬飛[12]分別利用四種酵母對鮮葛根酶解液進行發(fā)酵陳釀后,對其香氣成分進行分析,其中KIM酵母檢測出香氣種類最多,濃度最高,并且得到乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸、癸酸、己酸、辛酸、異戊醇、苯乙醇、4-乙基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚是構成葛根陳釀酒典型香氣的重要成分。

感官評估是接受或拒絕食物的最終標準,食物的感官質量可以通過估計食物在消費者心中產生的總體印象來評估,具有不準確、不確定的重復性特點[13]。傳統(tǒng)的食品感官評價法,由于評價人員的主觀因素的影響,會對結果造成較大的誤差[14]。模糊綜合評判是利用模糊數(shù)學的一些概念,將一些邊界不清、不易定量的因素定量化、綜合評價的一種方法[15]。在模糊建模中,通過因素集、評價集和權重之間的關系,運用模糊關系合成原理可以得出關于食品接受度的結論,從一定程度上改變了評價結果的客觀性。因此廣泛被用于對啤酒[15]、柑橘酒[16]、香腸[17]、茶[18]和乳制品[13]等食品的感官評價中。

本實驗以葛根為原料,經過淀粉的液化、糖化后,采用模糊數(shù)學綜合評價結合響應面試驗對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,得到具有葛根的清香、酒體澄清透明、風味獨特、營養(yǎng)豐富的養(yǎng)生酒,并對發(fā)酵成品的香氣成分進行檢測分析,旨在為葛根發(fā)酵酒提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮葛根 宜賓好葛農產品公司,切丁,60 ℃烘干,在高速粉碎機中粉碎后過40目篩,備用;α-淀粉酶(4000 U/g)、糖化酶(100000 U/g) 購自上海源葉生物科技有限公司;Lalvin EC1118酵母 法國萊蒙特公司;2-辛醇(色譜級) 成都市科隆化學品有限公司;其余試劑 均為國產分析純。

7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司;固相微萃取裝置(手動進樣器和50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭) 美國Supelco公司;2500A高速粉碎機 永康速澤工貿有限公司;HH.WH.600S恒溫水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學儀器有限公司;MLS-3781L-PC高壓滅菌鍋 日本松下健康醫(yī)療器械株式會社;ME204電子天平 梅特勒-托利多(上海)有限公司;PHSJ-5酸度計 上海雷磁新涇儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母的活化 稱取一定量的Lalvin EC1118酵母,加入到5%的無菌糖水中,在35 ℃溫度條件下?lián)u床活化30 min,直至糖水中出現(xiàn)大量小氣泡為止。

1.2.2 工藝流程

工藝要點:葛根洗凈切丁,60 ℃干燥,粉碎后,過40目篩,在80 ℃水浴糊化30 min。參照文獻[19]稍作修改,進行發(fā)酵前葛根淀粉的液化和糖化處理。在一定料水比、發(fā)酵初始pH、發(fā)酵溫度和酵母接種量條件下發(fā)酵7 d后,經過濾得到成品,再對酒樣進行感官評定。

1.2.3 感官評定 由20位(10男10女)經過感官評定的食品專業(yè)學生組成評價小組,為了提高可信度,評價員在評價前12 h不喝酒、不吸煙、不吃辛辣等刺激性的食品,評價結束后不準討論,評價下一樣品前,用清水漱口。填寫感官評定表,評價標準[20-21]如表1所示。

表1 葛根酒感官評定指標Table 1 The sensory evaluation of gegen wine

1.2.4 模糊數(shù)學模型的建立

1.2.4.1 葛根酒的因素集和評價集 因素集是影響被評判對象的指標集合[15],以色澤(u1)、香氣(u2)、滋味(u3)、典型性(u4)為4個因素,如表2所示,得到本研究的因素集U={ u1,u2,u3,u4}。

評語集是評價者對因素集反饋信息的結合,即為評級的等級[22]。以優(yōu)(v1)、良(v2)、中(v3)、差(v4)為評語等級,得到本研究的評語集V={ v1,v2,v3,v4}。

1.2.4.2 權重的確定 權重集就是評語集中各指標在總體感官品質中所占比重的集合,每個評語集對應一個權重系數(shù)[21]。請5位專業(yè)品評老師根據(jù)品評經驗及結果,給出權重模糊子集X={x1,x2,x3,x4}的隸屬度,xi=(1,2,3,4)為本研究的4個因素在感官整體品評中的重要程度,其隸屬度的數(shù)值范圍在0～1之間(保留2位小數(shù)),0為不重要,1為最重要。根據(jù)5位專家給出的數(shù)據(jù)構成5行4列的矩陣,然后對其進行行歸一化處理,最后對每一列進行平均值的計算,即得到評價指標模糊權向量a={a1,a2,a3,a4}。

1.2.4.3 模糊關系綜合評價集 參考文獻[15,20],采用模糊合成算子建立模糊綜合評價模型。將權重集a與模糊關系矩陣R相乘,得到模糊關系綜合評價集B=a·R。本研究采用秩加權平均原則對模糊綜合評價結果進行處理,用4、3、2、1依次代表優(yōu)、良、中、差,并作為各等級的秩,通過式(1)得到最后的等級值T。

式(1)

式(1)中,k:待定系數(shù)(取k=2),目的是控制較大的Bi所引起的作用。

1.2.5 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.2.5.1 單因素實驗 固定發(fā)酵初始pH5.0、發(fā)酵溫度28 ℃、酵母添加量0.4%,考察不同料水比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 (g/mL))對葛根酒的影響;固定料水比1∶5、發(fā)酵溫度28 ℃、酵母添加量0.4%,考察不同發(fā)酵初始pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)對葛根酒的影響;固定料水比1∶5、發(fā)酵初始pH5.0、酵母添加量0.4%,考察不同發(fā)酵溫度(22、25、28、31、34 ℃)對葛根酒的影響;固定選擇料水比1∶5、發(fā)酵初始pH5.0、發(fā)酵溫度28 ℃,考察不同酵母添加量(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6%)對葛根酒的影響。按照上述條件發(fā)酵完成后,以模糊數(shù)學得到的感官評價對蕨根米酒的品質進行分析,確定單因素最佳條件。

1.2.5.2 響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗的基礎上,采用Design-Expert 6.0.5軟件,根據(jù)Box-Behnken試驗設計,選擇pH(A)、發(fā)酵溫度(B)、酵母添加量(C)這3個為響應變量,以模糊數(shù)學得到的感官評價為響應值,進行3因素3水平響應面優(yōu)化試驗(表2)。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels table usedin Box-Behnken experiment

1.2.6 香氣成分的測定 參考Wang等[24]的方法稍作修改,采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(HS-SPME-GC-MS)進行檢測。

頂空固相微萃取:取4 mL樣品于15 mL頂空瓶中,再加入1 g NaCl和一個磁力轉子,然后用聚四氟乙烯隔墊密封。在50 ℃水浴平衡10 min,開啟磁攪拌器,將萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min,然后在GC進樣口熱解析5 min,進行GC-MS分析。

GC-MS條件[24-25]:所用的色譜柱為DB-Wax毛細管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);程序升溫:40 ℃保持3 min,以4 ℃/min升至160 ℃,再以7 ℃/min升至230 ℃,保持10 min;進樣口溫度為250 ℃;氦氣流速為1 mL/min;不分流。傳送線溫度為230 ℃;離子源溫度為230 ℃;EI離子源能量為70 eV;質譜掃描范圍m/z為33～450,掃描間隔為1 s。

香氣成分定性定量分析:利用計算機自帶的NIST譜庫進行對比分析,并參考相關文獻,對其進行定性分析;以2-辛醇(在體系的濃度為0.125 mg/L)為內標,采用半定量的方法來計算香氣物質的含量(如式2所示)。

待測香氣成分的含量=(待測香氣成分的峰面積×內標物含量)/內標物的峰面積

式(2)

1.2.7 理化及微生物指標的測定 酒精度的測定:酒精計法[21];殘?zhí)呛康臏y定(以葡萄糖計):直接滴定法[23];總酸的測定(以乙酸計):酸堿滴定法[23];甲醇含量的測定:氣相色譜法[23];菌落總數(shù)的測定:參照得到的數(shù)據(jù)GB/T 4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物檢驗 菌落總數(shù)測定》;大腸菌群的測定:GB/T 4789.3-2010《食品衛(wèi)生微生物檢驗 大腸菌群測定》;沙門氏菌的測定:GB/T 4789.4-2010《食品衛(wèi)生微生物檢驗 沙門氏菌測定》;志賀氏菌的測定:GB/T 4789.5-2010《食品衛(wèi)生微生物檢驗 志賀氏菌測定》;金黃色葡萄球菌的測定:GB/T 4789.10-2010《食品衛(wèi)生微生物檢驗金黃色葡萄球菌測定》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行處理,Origin 8.0軟件進行圖形繪制,Design-Expert 6.0.5軟件進行響應面試驗設計與結果分析。

2 結果與分析

2.1 葛根酒感官品質的模糊綜合評價

2.1.1 感官評價 20位感官評價者按照制定的標準,對在單因素條件料水比1∶3、發(fā)酵初始pH5.0、發(fā)酵溫度28 ℃、酵母添加量0.4%下發(fā)酵的葛根酒進行感官評價,評品結果見表3,并對品評結果進行歸一化處理得到模糊關系矩陣R單1。同樣的方法得到其他單因素條件下的模糊關系矩陣。

表3 單因素條件1的品評結果Table 3 The evaluation results of single factor condition No.1

2.1.2 評價指標的模糊權向量 5位專業(yè)品評老師給出權重模糊子集M,并對其進行歸一化處理見表4。得到模糊權向量a={0.16,0.23,0.42,0.19}。

表4 不同指標的隸屬度及歸一化處理結果Table 4 The membership degree of different indictors and the results of normalization processing

2.1.3 模糊綜合評價模型 以R單1為例,確定其模糊綜合評價模型B單1,同理可以得到其他單因素結果的評價模型。再根據(jù)秩加權平均原則式(1)計算出T單1=2.11,即處于等級良和中之間,更偏向于中,同理可以得到其他單因素結果的模糊評價等級值T。

T單1=a·R單1=(0.16 0.23 0.42 0.19)

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 最適料水比的確定 由圖1可以看出,不同料水比對葛根酒感官評價等級值有較大的差異,加水量過少或過多,均會影響葛根酒的品質。料水比為1∶3～1∶5時,葛根酒的感官評價等級值逐漸升高;料水比為1∶5～1∶7時,葛根酒的感官評價等級值逐漸降低;在料水比為1∶5時,葛根酒的感官評價等級值為3.70,感官評價等級最高。因此選擇1∶5為最適料水比。

圖1 不同料水比對感官評價等級值的影響Fig.1 Effects of different material/water ratio on sensory evaluation grade value

2.2.2 最適發(fā)酵初始pH的確定 發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH直接影響微生物的生長,從而影響發(fā)酵產物的形成。由圖2可知,發(fā)酵初始pH為4.0～5.5時,葛根酒的感官評價等級值逐漸升高;發(fā)酵初始pH為5.5～6.0時,葛根酒的感官評價等級值逐漸降低;在發(fā)酵初始pH為5.5時,葛根酒感官評價等級最高。因此,選擇發(fā)酵初始pH為5.5。

圖2 不同發(fā)酵初始pH對感官評價等級值的影響Fig.2 Effects of different fermentation initial pH on sensory evaluation grade value

2.2.3 最適發(fā)酵溫度的確定 微生物的生長代謝與溫度息息相關,發(fā)酵溫度的高低會影響微生物代謝產物的形成及產品的品質。由圖3可知,發(fā)酵溫度為22～28 ℃時,葛根酒的感官評價等級值逐漸升高;發(fā)酵溫度為28～34 ℃時,葛根酒的感官評價等級值逐漸降低;發(fā)酵溫度為28 ℃時,葛根酒感官評價等級最高。因此,選擇28 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖3 不同發(fā)酵溫度對感官評價等級值的影響Fig.3 Effects of different fermentation temperatures on sensory evaluation grade value

2.2.4 最適酵母添加量的確定 由圖4可知,隨著酵母添加量的增加,葛根酒的感官評價等級值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。酵母添加量為0.2%～0.5%時,葛根酒的感官評價等級值逐漸升高;酵母添加量為0.5%～0.6%時,葛根酒的感官評價等級值逐漸降低。這是因為,當酵母接種量較低時,酵母菌繁殖較慢,使得原料的利用率不高,從而使感官綜合等級偏低。酵母接種量過高時,酵母菌大量繁殖,消耗了原料中大量的碳源,導致發(fā)酵提前結束,并且酵母會發(fā)生自溶的情況,影響產品的風味。故選擇0.5%為最適酵母添加量。

圖4 不同酵母添加量對感官評價等級值的影響Fig.4 Effects of different yeast inoculums concentrations on sensory evaluation grade value

2.3 響應面試驗結果

20位感官評價者按照制定的標準對17組試驗的酒樣進行感官評定,并對品評結果進行歸一化處理得到模糊關系矩陣R1～R17,根據(jù)上述算法可以得到模糊評價等級值T1～T17。

采用Design-Expert 6.0.5軟件,根據(jù)Box-Behnken試驗設計,結果如表5所示。并對評定結果進行方差分析結果見表6。通過對各因素進行多元回歸擬合后,得到以等級值(Y)與各因素的回歸方程為:

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

Y=-142.26903+34.49433A+2.08031B+78.1875C-2.521A2-0.027528B2-46.275C2-0.10333AB-7.2AC+0.275BC

從方差分析的結果可以看出,模型極顯著(p<0.01),失擬項不顯著(p>0.05),說明擬合模型能較好的對響應值進行預測,模型可用。擬合模型的決定系數(shù)R2=0.9413,表明模型方差擬合度較好。各因素之間存在交互作用的影響,而不是簡單的一次關系。其中方程一次項B極顯著(p<0.01),A、C均不顯著(p>0.05);交互項AC極顯著(p<0.01),AB、BC均不顯著(p>0.05);二次項B2顯著(p<0.05),A2、C2均極顯著(p<0.01)。

通過軟件Design-Expert 6.0.5分析,得到最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵初始pH為5.5、發(fā)酵溫度為30 ℃、酵母接種量為0.5%,在此條件下預測感官評價等級值為3.63,即發(fā)酵制得的葛根酒的品質介于優(yōu)良之間,更偏于優(yōu)。在此條件下進行了三次平行試驗,驗證其模型的有效性,最終得到感官綜合評價等級值為3.68±0.03,與預測值相差不大。說明該模型能較好地反映發(fā)酵條件與感官評定之間的關系,因此采用響應面法得到的實驗條件及結果可靠。

2.4 葛根酒的成分分析

2.4.1 葛根酒香氣成分分析 采用HS-SPME結合GC-MS法對葛根酒的香氣成分進行檢測并分析,結果如表7。共檢測出30種香氣物質,醇類12種、酯類10種、酸類5種、醛類1種、酮類1種、酚類1種,醇類、酯類和酸類物質的含量分別為8.414、2.229、0.312 mg/L。

表7 葛根酒中揮發(fā)性香氣物質及含量Table 7 The volatile aroma compounds and content in gegen wine

葛根酒的風味不是由單一香氣成分形成,而是源于構成風味結構組分的醇類、酯類、酸類、醛類等相互協(xié)調作用而形成[26]。醇類物質是葛根酒中含量較多的一類香氣物質,主要是由酵母代謝產生。葛根酒中醇類物質較多為異戊醇(3.682 mg/L)、苯乙醇(2.473 mg/L)、異丁醇(1.463 mg/L)、異丙醇(0.518 mg/L)和正丙醇(0.164 mg/L)等高級醇。高級醇是在發(fā)酵過程中有助于調節(jié)酵母中間代謝的副產物[27],同時高級醇是風味活性酯的前提物質[28],對葛根酒的風味的形成具有重要作用。其中異戊醇和苯乙醇含量相對較高,這與史路路[29]和蔣鵬飛[12]的研究報道一致,異戊醇具有濃郁的蘋果白蘭地香;苯乙醇是酒中特征的香氣物質,由苯丙氨酸代謝產生,具有迷人的玫瑰香味。在葛根酒中還檢測出了香茅醇(花香和柑橘香)、糠醇(焦香)和桉葉油醇(樟腦、青草香),這些物質是賦予葛根酒豐富香味層次的不可忽視的揮發(fā)性成分。

酯類物質具有令人愉悅的花香和水果香氣,對葛根酒芳香的呈現(xiàn)有不可替代的作用。在葛根酒中檢測出的酯類多為乙酯類,例如乙酸乙酯(水果香)、己酸乙酯(蘋果香、茴香)、辛酸乙酯(菠蘿香、花香)、癸酸乙酯(椰子香)、月桂酸乙酯(花香、水果香、奶油香)、棕櫚酸乙酯(奶油香)、苯甲酸乙酯(水果香)[30],乙酯類化合物較多可能是由于乙醇的大量存在[31]。此外在葛根酒中還檢測出乙酸異戊酯(清香、香蕉香)、乙酸苯乙酯(甜蜜的玫瑰香)等,這些酯類給予葛根酒果香及花香,對其風味具有積極的作用。

較醇類和酯類物質,葛根酒中酸類物質含量明顯較少。酒中的大多酸類物質來源于酵母代謝的副產物[31],在葛根酒中檢測的酸類物質有乙酸、異丁酸、己酸、辛酸、癸酸,在蔣鵬飛[12]分析葛根酒的揮發(fā)性成分中也檢出這幾種酸類物質。一般C6～C12脂肪酸具有奶酪和油脂氣味,因此這些酸類化合物組成了葛根酒愉快的奶酪和脂肪香味。此外酸類化合物還影響酒的滋味,酒體中酸類物質較少時,酒味寡淡且余味短;酸類物質較多時,酸味重,酒味烈且粗糙[12]。因此只有適量的酸類化合物才能使酒中各類香氣成分協(xié)調、平衡。

此外,在葛根酒中還檢測出了乙縮醛(芳香)、3-羥基-2-丁酮(愉快的奶香)這兩種醛類物質和酮類物質,同時在梁香[32]發(fā)酵的薏米葛根黃酒、史路路[29]發(fā)酵的葛根黃酒、蔣鵬飛[12]發(fā)酵的葛根酒中均未檢測出,可能是由于酵母種類和原料的差異所致,其中3-羥基-2-丁酮在酒類調香中具有重要作用。Berenguer等[33]研究表明,醛類、酮類等物質雖然含量較少,但對酒體風味的形成具有重要作用。正是由于葛根酒中醇、醛、酸、酯等組分構成了其特有的風味,使得葛根酒不僅具有較好的滋味,且具有一定的保健功效。

2.4.2 葛根酒理化成分分析 對發(fā)酵條件優(yōu)化后得到的葛根酒進行理化成分分析,結果如表8所示。酒精體積分數(shù)為8.16%±0.25%,殘?zhí)呛繛?6.38±0.12) g/L,總酸含量為(4.46±0.08) g/L,甲醇含量為(0.23±0.01)g/L,符合國家標準,菌落總數(shù)小于47 CFU/mL,大腸菌群和致病菌均未檢出。

表8 葛根酒主要理化成分及微生物分析Table 8 Analysis of main components and microbes of gegen wine

3 結論

通過模糊綜合評定結合響應面法對葛根酒發(fā)酵條件進行優(yōu)化,得到最優(yōu)發(fā)酵條件為:發(fā)酵初始pH5.5、發(fā)酵溫度30 ℃、酵母接種量0.5%,在此條件下感官評價等級值為3.68,品質等級介于優(yōu)良之間,更偏于優(yōu)。葛根酒中共檢測到30種香氣成分,醇類以異丁醇、異丙醇、苯乙醇為主;乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯在酯類物質中相對較多;此外檢測出酸類、醛類、酮類物質,這些香氣物質相互融合協(xié)調,構成了葛根酒獨特的風味。發(fā)酵后葛根酒的酒精體積分數(shù)為8.16%,甲醇含量和微生物指標均符合國家標準,酒呈棕黃色,澄清透明,葛根清香和酒香協(xié)調、平衡,清冽爽口。采用模糊綜合評定結合響應面法優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)和HS-SPME/GC-MS法測定葛根酒的香氣成分具有一定的實用價值,對葛根資源的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。