吳 笛， 雷 昌， 唐 林

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙410208）

吡咯里西啶生物堿 （pyrrolizidine alkaloids）是一類由植物合成的天然有機(jī)化合物。迄今已發(fā)現(xiàn)400多個(gè)不同結(jié)構(gòu)的吡咯里西啶生物堿，存在于世界各地6 000多種有花植物中，這些植物多集中于菊科、紫草科、豆科、蘭科。在已發(fā)現(xiàn)的吡咯里西啶生物堿中，約半數(shù)對(duì)人類和動(dòng)物有毒，其毒性作用主要表現(xiàn)為肝臟毒性、肺臟毒性、基因毒性、致癌作用、神經(jīng)毒性。因服用含吡咯里西啶生物堿的草藥、補(bǔ)劑、茶，或間接的食物污染 ［如蜂蜜、牛奶或肉類 （因動(dòng)物攝取含吡咯里西啶生物堿的花蜜、牧草而蓄積毒性）等］導(dǎo)致人畜中毒的事件在許多國(guó)家均有報(bào)道［1］。

款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，為常用中藥材，具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰之功效。款冬含有微量的吡咯里西啶生物堿，1976年以來(lái)從中陸續(xù)檢測(cè)或分離得到幾種毒性和非毒性的吡咯里西啶生物堿［2-5］，其中克氏千里光堿是一種典型的毒性吡咯里西啶生物堿，是款冬中最主要的該類成分［5］。本課題組曾針對(duì)款冬花中的吡咯里西啶生物堿進(jìn)行植化分離，成功分離得到克氏千里光堿，但沒(méi)有分離得到其他吡咯里西啶生物堿［6］。中醫(yī)認(rèn)為，炮制可增強(qiáng)藥物的效用、減輕或消除藥物的毒性或副作用，款冬花臨床多用蜜炙品 （蜜款冬花），但蜜炙對(duì)其是否具有減毒作用目前尚無(wú)定論。

基于上述原因，本課題組認(rèn)為有必要針對(duì)款冬花中的毒性吡咯里西啶生物堿開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的定量分析方法，通過(guò)比較蜜炙前后款冬花中毒性吡咯里西啶生物堿的含有量，分析蜜炙對(duì)其是否具有減毒作用。針對(duì)款冬 （包括花蕾、花、葉）中吡咯里西啶生物堿定量分析的不足之處在于，采用雜質(zhì)干擾大、準(zhǔn)確度低的比色法檢測(cè)總生物堿的含有量，結(jié)果準(zhǔn)確性存疑［7-8］；或所建立的定量分析方法靈敏度不高，樣品處理方法復(fù)雜，不利于操作［9-12］。

基于款冬花中吡咯里西啶生物堿的低含有量 （約為0.015%）［2］及液質(zhì)聯(lián)用 （LC-MS） 技術(shù)的高靈敏度，本研究擬采用高效液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用 （HPLC-ESI-ITMS）技術(shù)，針對(duì)款冬花中的微量毒性成分克氏千里光堿建立一種簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確靈敏的含有量測(cè)定方法，考察蜜炙前后其變化，分析蜜炙對(duì)款冬花是否具有減毒作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Surveyor LC系統(tǒng)、LCQ DECA XPplus質(zhì)譜儀（包括電噴霧離子源和離子阱質(zhì)量分析器）、儀器控制和數(shù)據(jù)采集處理軟件 （Xcalibur1.3工作站） （美國(guó) Thermo Finnigan公司）；TSKgel ODS-100S柱 （250 mm ×2.0 mm，5 μm，日本Tosoh公司）；KQ-500B型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；AE200型分析天平 （萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；BP211D型分析天平（十萬(wàn)分之一）、PB-10型酸度計(jì) （德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 材料 款冬花采集于國(guó)內(nèi)各主要產(chǎn)區(qū)，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院吳笛鑒定為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾。蜜款冬花的制備按照2015年版《中國(guó)藥典》一部款冬花項(xiàng)下相關(guān)要求及四部規(guī)定的蜜炙法進(jìn)行［13-14］。藥材和蜜炙品在60℃下干燥后，粉碎成細(xì)粉（過(guò)3號(hào)篩）。

克氏千里光堿對(duì)照品為自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS鑒定，純度經(jīng)HPLC、LC-MS檢測(cè)其含有量大于98%；乙腈為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；96%甲酸為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Tedia公司；其他試劑均為分析純；水為純凈水，購(gòu)于杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件 TSKgel ODS-100S柱 （250 mm×2.0 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.2%甲酸 （18∶82）； 體積流量0.2 mL／min； 柱溫 25℃； 進(jìn)樣量 2 μL； 電噴霧離子化（ESI）；正離子模式；霧化氣 （氮?dú)猓毫?20.64 kPa；輔助氣 （氮?dú)猓毫?8.95 kPa；噴霧電壓5 kV；毛細(xì)管溫度300℃；毛細(xì)管電壓9 V；選擇克氏千里光堿的2個(gè)二級(jí)離子m／z 168、150作為定量分析離子。

2.2 對(duì)照品溶液制備 取克氏千里光堿對(duì)照品適量，精密稱定，加0.1%鹽酸制成每1 mL含100 μg該成分的溶液，作 為 貯 備 液， 分 別 稀 釋 至 200、 100、 50、 10、 1、0.5 ng／mL， 即得。

2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末0.5 g，精密稱定，加入50 mL 0.1%鹽酸超聲15 min，取出，0.1%鹽酸補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，0.1%鹽酸稀釋10倍，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 線性關(guān)系考察、最低檢測(cè)限 （LOD）和最低定量限（LOQ） 取 “2.2”項(xiàng)下貯備液，分別稀釋至1 000、500、200、 100、 50、 10、 1、 0.5 ng／mL， 在 “2.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)行分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，逐步稀釋對(duì)照品溶液，按信噪比3和10分別計(jì)算LOD和LOQ，得回歸方程Y＝354 278X＋868 320 （R2＝0.997 2）， 在 0.5～200 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， LOD 為100 pg／mL， LOQ 為500 pg／mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 日內(nèi)精密度 每3 h 1次，取10、100、200 ng／mL對(duì)照品溶液在 “2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積的RSD分別為1.96%、1.65%、0.91%，表明儀器日內(nèi)精密度良好。

2.5.2 日間精密度 1次／d， 取10、 100、 200 ng／mL對(duì)照品溶液在 “2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣5 d，測(cè)得峰面積的RSD分別為2.08%、2.43%、1.99%，表明儀器日間精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品6份，每份0.5 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得克氏千里光堿含有量RSD為2.31%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.6”項(xiàng)下同一供試品，在 “2.1”項(xiàng)條件下于0、6、12、24、48 h連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得克氏千里光堿峰面積RSD為2.08%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同一批樣品0.25 g，精密稱定，精密加入高、中、低3個(gè)劑量的克氏千里光堿對(duì)照品，共9份，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 克氏千里光堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝9）

2.9 樣品含有量測(cè)定 取藥材和蜜炙品 （蜜炙品取樣量折算成對(duì)應(yīng)藥材量），按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 克氏千里光堿含有量測(cè)定結(jié)果 （μg／g，±s， n＝3）

表2 克氏千里光堿含有量測(cè)定結(jié)果 （μg／g，±s， n＝3）

注：a為樣品1的蜜炙品，b為樣品4的蜜炙品，c為樣品7的蜜炙品

編號(hào) 來(lái)源 采集時(shí)間 含有量1 河北蔚縣 2016-12 88.35±0.62 2a — — 57.60±1.28 3a — — 59.11±0.80 4 山西廣靈 2016-12 67.52±0.95 5b — — 56.04±2.36 6b — — 53.66±1.77 7 甘肅隴西 2017-01 102.33±1.84 8c — — 80.27±0.24 9c — — 78.56±1.73 10 甘肅渭源 2017-01 93.02±2.26 11 甘肅靈臺(tái) 2017-01 77.43±0.83 12 山西沁源 2017-02 70.55±0.95 13 重慶巫溪 2017-04 52.66±2.73 14 河南洛陽(yáng) 2017-11 45.38±1.90

3 討論

3.1 流動(dòng)相優(yōu)化 酸性流動(dòng)相條件下生物堿在質(zhì)譜儀中更易離子化，一般生物堿的檢測(cè)均選擇正離子模式?？疾炝怂嵝粤鲃?dòng)相條件下不同pH對(duì)克氏千里光堿色譜行為的影響，結(jié)果表明流動(dòng)相pH越低，克氏千里光堿峰形越好，隨著pH升高，拖尾現(xiàn)象逐漸嚴(yán)重；3個(gè)pH （2.5、3.0、3.5）中，pH2.5時(shí)峰形最好，pH3.5時(shí)拖尾嚴(yán)重。同時(shí)考察了乙腈-甲酸水、甲醇-甲酸水系統(tǒng)對(duì)克代千里光堿色譜行為的影響，結(jié)果表明前者較后者分離效果更好，峰形更銳。經(jīng)比較，選擇乙腈-0.2%甲酸 （pH 2.5）作為流動(dòng)相。3.2 定量分析離子選擇 克氏千里光堿的二級(jí)質(zhì)譜顯示有3個(gè)特征碎片離子，即m／z 168、150、122，見(jiàn)圖1。為提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)選擇豐度較高的二級(jí)離子m／z 168、150作為定量分析離子。

圖1 樣品分析圖譜

3.3 提取程序優(yōu)化 重點(diǎn)考察了不同溶劑、提取方法對(duì)克氏千里光堿提取效率的影響?？紤]到指標(biāo)成分為生物堿，在考察提取溶劑時(shí)選擇了不同濃度的酸性溶液，結(jié)果表明，以50 mL 0.1%鹽酸為溶劑超聲15 min時(shí)，提取效率較高。

3.4 雜質(zhì)峰 款冬花供試品溶液的選擇離子色譜圖及二級(jí)離子色譜圖 （圖1）均顯示有一較小雜質(zhì)峰，表明尚含有克氏千里光堿的同分異構(gòu)體，且具有相同的特征碎片離子m／z 168、150，但含有量遠(yuǎn)低于克氏千里光堿。文獻(xiàn)［5］報(bào)道款冬含有新克氏千里光堿，為克氏千里光堿的同分異構(gòu)體 （僅C15、C20間雙鍵構(gòu)型不同，克氏千里光堿為Z構(gòu)型，新克氏千里光堿為E構(gòu)型），推測(cè)此雜質(zhì)峰即為新克氏千里光堿。因缺乏新克氏千里光堿的對(duì)照品，此雜質(zhì)峰的歸屬有待進(jìn)一步確證。

3.5 克氏千里光堿線性范圍 克氏千里光堿在0.5～200 ng／mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，質(zhì)量濃度高于500 ng／mL時(shí)變差，即質(zhì)量濃度越高線性關(guān)系越差，具體原因有待深入探討。因此，在制備供試品溶液時(shí)，提取液過(guò)濾后取續(xù)濾液，用0.1%鹽酸稀釋10倍，以供LC-MS進(jìn)樣分析。

3.6 克氏千里光堿含有量測(cè)定 不同產(chǎn)地款冬花中克氏千里光堿含有量差別較大，這可能與其不同的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)；蜜炙品中克氏千里光堿含有量均顯著低于對(duì)應(yīng)藥材，表明蜜炙可一定程度上降低其含有量，這可能是在蜜炙的高溫炒制過(guò)程中該成分部分分解或發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng)所致，表明蜜炙對(duì)款冬花可能具有一定的減毒作用，具體原因有待深入研究。

2015年版 《中國(guó)藥典》一部收載了數(shù)種含有毒性吡咯里西啶生物堿的藥材，如千里光、野馬追、款冬花、紫草，并涉及數(shù)十種成方制劑，且大多數(shù)品種缺乏對(duì)此類成分的安全限量規(guī)定，其潛在的用藥風(fēng)險(xiǎn)可能被忽視?；趯?duì)中藥安全性問(wèn)題的重視及降低可能藥物不良反應(yīng)和用藥風(fēng)險(xiǎn)的考慮，有必要開(kāi)展相關(guān)基礎(chǔ)研究，進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)含有毒性吡咯里西啶生物堿的中藥加強(qiáng)質(zhì)量控制，設(shè)定安全限量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ESI-ITMS技術(shù)針對(duì)款冬花中主要毒性成分克氏千里光堿建立了定量分析方法，該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確靈敏，可為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。