付遠(yuǎn)飛， 劉惠婷， 郭宏雅， 王 劍

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

皮膚衰老與成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、分泌合成膠原蛋白功能降低或異常有關(guān)。白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，具有養(yǎng)血平肝、斂陰止汗等功效，其味甘、酸，性微寒，具有養(yǎng)血美容之功效［1-2］。本實(shí)驗(yàn)以D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，經(jīng)Franz擴(kuò)散池透皮處理得到的白芍經(jīng)皮透過液作用于模型細(xì)胞，研究其對(duì)該模型的影響，以期探討白芍抗衰老作用。

1 材料

1.1 藥材 白芍購自廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)YPA5I0003，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)王劍教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。

1.2 細(xì)胞 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞從新生昆明小鼠軀干皮膚體外分離培養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠30只，雌雄兼有，體質(zhì)量 （22±2）g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵2013-0020）5只雌鼠與10只雄鼠合籠飼養(yǎng)，其余15只雌鼠合籠飼養(yǎng)。

1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶 （美國(guó)Gibco公司）；PBS（江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司）；維生素E（美國(guó)Sigma公司）；D-半乳糖 （廣州威佳科技有限公司）；CCK-8試劑盒 （日本Dojindo公司）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin-V／PI（美國(guó) BioLegend 公司）； PI（美國(guó) Nexcelom Bioscience公司）。

1.5 儀器 SW-CJ-2F雙人單面垂直凈化工作臺(tái) （上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；Galaxy S二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf公司）；XSZ-D2倒置生物顯微鏡 （重慶光學(xué)儀器廠）；GL-21 M離心機(jī) （上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；打粉機(jī) （瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）、LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （德國(guó) Heidolph公司）、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 （鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；YB-P6智能透皮儀 （天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀 （德國(guó)Gonnotec公司）；TC-15恒溫水浴鍋 （海寧市新華醫(yī)療器械廠）；WX-2300高精度多功能酶標(biāo)儀 （西安唯信機(jī)電設(shè)備有限公司）；IX71倒置熒光顯微鏡 （日本O-lympus公司）；FACSJazz流式細(xì)胞儀 （美國(guó)BD公司）。

2 方法

2.1 小鼠皮膚成纖維細(xì)胞制備 采用組織塊培養(yǎng)法。取同一母鼠的同一胎幼鼠，共8只，出生2～3 d后頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡10 min，超凈臺(tái)內(nèi)分離軀干部皮膚，75%乙醇再次浸泡消毒后剪成小塊，PBS緩沖液漂洗去除血液，均勻轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，平鋪于瓶?jī)?nèi)，底面朝上倒置5 min后翻轉(zhuǎn)平放，加DMEM完全培養(yǎng)基使其剛好浸沒組織塊，置于恒溫培養(yǎng)箱中充分培養(yǎng)，24 h后觀察組織塊是否牢固平貼于瓶底，待其穩(wěn)固貼牢后加入適量DMEM完全培養(yǎng)基，每2 d更換1次，8～10 d后細(xì)胞鋪滿瓶底，消化傳代。

2.2 細(xì)胞傳代、純化 鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶瓶底70%～80%時(shí)即可用于傳代，PBS沖洗細(xì)胞后棄去PBS，重復(fù)1次，胰酶消化，移入離心管，離心后棄上清液，加DMEM完全培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，吹打混勻后按1∶3的比例傳代培養(yǎng)，約每3 d傳代1次。同時(shí)，通過差速貼壁法純化小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，穩(wěn)定傳3～6代后即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 白芍經(jīng)皮透過液制備 取20 g白芍打成粗粉，加入200 mL 70%乙醇浸泡1 h，微波提取30 min，重復(fù)1次，合并2次提取液，過濾，濾液減壓濃縮后離心取上清液，作為濃縮液。取雌鼠15只，頸椎脫臼處死，剪取腹部皮膚，刮毛并除去脂肪，角質(zhì)層向下平整鋪放在提前準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，生理鹽水反復(fù)沖洗至無血色后，修剪其大小為略大于擴(kuò)散池面積，固定在Franz擴(kuò)散池的接受池與給藥池之間，接受池中加入40%乙醇作為接受介質(zhì)，給藥池中加入濃縮液6 m，再將 Franz擴(kuò)散池放置在智能透皮儀中（37℃、150 r／min），24 h后收集接受池內(nèi)透過液，減壓濃縮至干，加6 mL培養(yǎng)基復(fù)溶，即得。冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀測(cè)得滲透壓與生理鹽水相當(dāng)時(shí)，過濾除菌備用。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、給藥 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，以1×105／mL細(xì)胞密度分別接種于6、96孔板中，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，正常組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含0.25 mol／L D-半乳糖的完全培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入含0.25 mol／L D-半乳糖、0.05%維生素E的完全培養(yǎng)基，白芍經(jīng)皮透過液分 別 加 入 含 0.25 mol／L D-半 乳 糖 2、 10、 20、 100、200 mg／mL白芍經(jīng)皮透過液的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.5 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用CCK-8法。取 “2.4”項(xiàng)下96孔板，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加入CCK-8溶液10 μL，放置培養(yǎng)箱中2 h后取出，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

2.6 細(xì)胞衰老檢測(cè) 采用 β-半乳糖苷酶染色法。取“2.4”項(xiàng)下96孔板，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗1次，棄去PBS，每孔加入65 μL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫下固定，15 min后吸棄固定液，PBS沖洗3 min，重復(fù)2次，吸棄PBS，每孔加65 μL工作液，37℃孵育過夜，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)綠色的為衰老細(xì)胞，鏡下視野選取200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞衰老率。

2.7 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)法。取 “2.4”項(xiàng)下的6孔板，0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL，70%預(yù)冷乙醇固定、PI染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

2.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取 “2.4”項(xiàng)下6孔板，加入預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞，吸棄PBS，加入適量結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（密度1×105／mL）， 細(xì)胞懸液中加入 Annexin-V／PI工作液孵育，過篩網(wǎng)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 白芍經(jīng)皮透過液對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞活性的影響 表1顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，白芍經(jīng)皮透過液組其活性顯著升高 （P＜0.05），在20 mg／mL時(shí)更明顯；與陽性對(duì)照組比較，白芍經(jīng)皮透過液10、20、100 mg／mL組其活性也顯著升高 （P＜0.05）。

表1 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞活性的影響 （±s， n＝6）

表1 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞活性的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別 劑量／（mg·mL－1） 吸光度正常組 — 0.795±0.019模型組 — 0.392±0.201??陽性對(duì)照組 — 0.588±0.019＃白芍經(jīng)皮透過液組 2 0.592±0.020＃白芍經(jīng)皮透過液組 10 0.661±0.032?！靼咨纸?jīng)皮透過液組 20 0.768±0.019?！靼咨纸?jīng)皮透過液組 100 0.691±0.032?！靼咨纸?jīng)皮透過液組 200 0.587±0.012＃

3.2 白芍經(jīng)皮透過液對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性的影響 圖1、表2顯示，正常組僅有少量細(xì)胞β-半乳糖苷酶染色陽性，細(xì)胞衰老率低；與正常組比較，模型組β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞衰老率顯著上升 （P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，陽性對(duì)照組、白芍經(jīng)皮透過液組細(xì)胞衰老率顯著下降 （P＜0.05），其中20 mg／mL組顯著低于陽性對(duì)照組 （P＜0.05）。

表2 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞衰老率的影響 （±s， n＝6）

表2 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞衰老率的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別 劑量／（mg·mL－1） 細(xì)胞衰老率／%正常組 — 19.65±0.021模型組 — 66.76±0.022??陽性對(duì)照組 — 58.73±0.035＃白芍經(jīng)皮透過液組 2 61.11±0.031＃白芍經(jīng)皮透過液組 10 53.78±0.029＃白芍經(jīng)皮透過液組 20 51.09±0.040＃△白芍經(jīng)皮透過液組 100 59.19±0.032＃白芍經(jīng)皮透過液組 200 60.96±0.043＃

3.3 白芍經(jīng)皮透過液對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞周期的影響 表3顯示，與正常組比較，模型組G0／G1期生長(zhǎng)顯著抑制 （P＜0.01）；與模型組比較，白芍經(jīng)皮透過液組G0／G1期細(xì)胞比例顯著升高 （P＜0.05），并與陽性對(duì)照組比較無顯著差異 （P＞0.05）。另外，與正常組比較，模型組S期細(xì)胞比例顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較，白芍經(jīng)皮透過液組其比例顯著升高 （P＜0.05），細(xì)胞DNA合成增加；與陽性對(duì)照組比較，白芍經(jīng)皮透過液 10、20、100 mg／mL組其比例也顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）， 以20 mg／mL組更明顯。但各組G2／M比例均無明顯變化 （P＞0.05）。

3.4 白芍經(jīng)皮透過液對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響 表4顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，白芍經(jīng)皮透過液組其凋亡率顯著降低 （P＜0.05）；與陽性對(duì)照組比較，白芍經(jīng)皮透過液10、 20、 100 mg／mL 組顯著降低 （P＜0.05）。

圖1 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性的影響 （×100）（n＝6）

表3 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞周期的影響 （±s， n＝6）

表3 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞周期的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量／（mg·mL－1）（G0／G1） ／% S／% （G2／M）／%正常組 — 89.62±0.21 6.03±0.17 4.35±0.11模型組 — 92.07±0.35?? 3.69±0.12?? 4.24±0.08陽性對(duì)照組 — 91.13±0.11＃ 5.04±0.20＃ 3.83±0.14白芍經(jīng)皮透過液組 2 91.15±0.26＃ 5.01±0.10＃ 3.84±0.14白芍經(jīng)皮透過液組 10 91.04±0.13＃ 5.60±0.11?！?3.36±0.11白芍經(jīng)皮透過液組 20 90.74±0.09＃ 5.94±0.20?！鳌?.32±0.18白芍經(jīng)皮透過液組 100 91.09±0.17＃ 5.51±0.13＃△ 3.40±0.11白芍經(jīng)皮透過液組 200 91.25±0.26＃ 4.91±0.11＃ 3.84±0.14

表4 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響 （±s， n＝6）

表4 對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的影響 （±s， n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別 劑量／（mg·mL－1） 細(xì)胞凋亡率／%正常組 — 5.01±0.10模型組 — 43.39±0.16??陽性對(duì)照組 — 24.99±0.20＃白芍經(jīng)皮透過液組 2 25.01±0.09＃白芍經(jīng)皮透過液組 10 17.06±0.14?！靼咨纸?jīng)皮透過液組 20 9.15±0.11?！靼咨纸?jīng)皮透過液組 100 18.66±0.12?！靼咨纸?jīng)皮透過液組 200 25.14±0.09＃

4 討論

白芍為養(yǎng)血柔肝、斂陰止痛之要藥，其有效成分主要為白芍總苷，具有止痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，廣泛用于治療各種皮膚病［3］，而且具有抗氧化活性［4］，而且從白芍中提取出的五沒子?；咸烟且簿哂邢嗤饔茫?］。但白芍提取液中有效成分的口服生物利用度較低［6-7］，從而限制了相關(guān)應(yīng)用，而且在含白芍的局部外用制劑中缺少透皮藥液研究，故本實(shí)驗(yàn)將白芍經(jīng)皮透過液作用于損傷細(xì)胞以探究白芍抗衰老作用。白芍提取液經(jīng)過透皮處理后，能充分模擬藥物透皮吸收過程，與白芍提取液相比能顯著提高藥效，更能代表藥物生物利用度，為中醫(yī)藥應(yīng)用于皮膚抗衰老外用制劑的研發(fā)提供新思路。

皮膚成纖維細(xì)胞作為皮膚真皮中的主要細(xì)胞組成，其生物學(xué)特性變化可作為皮膚老化的決定性因素。本實(shí)驗(yàn)選用D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞損傷模型［8］，它作用于細(xì)胞時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)半乳糖含有量升高，醛糖還原酶催化還原，以半乳糖醇形式存在，使細(xì)胞代謝失常，進(jìn)而導(dǎo)致衰老［9-10］。

β-半乳糖苷酶作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志酶，對(duì)其進(jìn)行染色試驗(yàn)可用于判斷細(xì)胞衰老狀況［11］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度白芍經(jīng)皮透過液可減少β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞，降低細(xì)胞衰老率，而且在20 mg／mL時(shí)效果最強(qiáng)。另外，白芍經(jīng)皮透過液在高質(zhì)量濃度下并未呈現(xiàn)出更明顯的作用，可能是由于高質(zhì)量濃度時(shí)滲透性物質(zhì)過多，從而對(duì)正常生理狀態(tài)下的細(xì)胞會(huì)造成非特異性影響。

細(xì)胞周期變化可反映細(xì)胞增殖情況［12］，G0／G1期細(xì)胞比例上升，S期細(xì)胞比例下降，表明細(xì)胞生長(zhǎng)受到阻滯，增殖能力減弱，細(xì)胞出現(xiàn)損傷甚至衰老。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白芍經(jīng)皮透過液可使細(xì)胞G0／G1期比例降低，S期比例升高，而S期為DNA合成期，推測(cè)白芍對(duì)小鼠皮膚成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)G0／G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)變，增加細(xì)胞DNA合成，從而加速細(xì)胞增殖。

綜上所述，白芍經(jīng)皮透過液可通過對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞周期的作用來增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，改善D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞損傷，對(duì)其具有保護(hù)作用，提示白芍可用于皮膚抗衰老產(chǎn)品的開發(fā)。但白芍經(jīng)皮透過液中的主要有效成分尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。