高燕萍， 魏榮銳， 吳 強， 張亞梅， 鐘囯躍

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌330000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西南昌 330000）

無尾果Coluria longifolia Maxim.是薔薇科無尾果屬植物，為藏藥 “熱袞巴”主要來源品種之一，產(chǎn)于我國甘肅、青海、云南、西藏等地，生于海拔2 700～4 100 m的區(qū)域，可用于治療頭痛、眩暈、肝陽上亢、月經(jīng)不調(diào)、疝氣。目前，鮮有無尾果及同屬其他植物化學(xué)成分及藥理作用的報道，課題組前期從其全草中分離鑒定出5個三萜［1］和一些黃酮類化合物［2-3］；魏春華等［4］發(fā)現(xiàn)它具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用，其中抗炎作用與提高抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制炎癥因子TNF-α、PGE2釋放有關(guān)。

“熱袞巴”最早記載于 《月王藥診》“傷科外敷藥和內(nèi)服藥”中，《四部醫(yī)典》《概念讓釋》《晶珠本草》等藏醫(yī)藥古籍文獻中也均有記載，具有祛淤血、清熱消炎等功效，臨床常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。近年來，隨著人們對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的深入研究，發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠的遺傳背景和免疫病理學(xué)改變與臨床類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)改變、發(fā)病機制等方面存在許多相似特征［5］； 陳哲等［6］報道， 4～5周齡的Wistar大鼠構(gòu)建Ⅱ型膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型時，建模成功率達83.3%。目前認為，TNF-α直接參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨的炎癥和破壞，而NF-κB通路是病情進展中滑膜炎癥重要信號通路，在炎性反應(yīng)、血管形成中發(fā)揮重要作用［7-8］。

因此，本實驗研究無尾果醇提物對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響，并基于NF-κB通路對其作用機制進行初步研究，為該藏藥開發(fā)利用及藥效物質(zhì)、質(zhì)量控制研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 無尾果購自成都荷花池藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘囯躍教授鑒定為薔薇科植物無尾果Coluria longifolia Maxim.，80%乙醇冷浸提取后濃縮，即得其醇提物。地塞米松注射劑 （浙江仙琚制藥股份有限公司，批號16 070 702 A）。 2 mg／mL溶于0.05 mol／L 冰醋酸的牛Ⅱ型膠原 （CⅡ）、不完全弗氏佐劑 （IFA） （美國Chondrex公司）；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2定量酶聯(lián)檢測試劑盒 （深圳達科為生物技術(shù)有限公司）；IκBα、p65抗體 （美國CST公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 動物 SPF級Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量（160±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SCXK（湘） 2013-0002。

1.3 儀器 ELx800酶標(biāo)儀 （美國BioTek公司）；Milli-Q（18.2 MΩ）超純水系統(tǒng) （法國Millipore公司）；高速勻漿機 （德國IKA公司）；R-220SE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （瑞士Buchi公司）；大小鼠足趾容積測量儀 （美國IITC公司）。

2 方法

2.1 抗原制備 將牛Ⅱ型膠原蛋白按4 mg／mL質(zhì)量濃度溶于10 mmol／L的冰醋酸中，攬拌均勻后置于4℃冰箱中過夜。然后，將其與等體積不完全弗氏佐劑 （IFA）混合，吸液槍反復(fù)抽吸至混合物完全乳化，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，造模前1 d禁食不禁水12 h。先取乳化后的CⅡ與IFA，按 200 μg CⅡ／只的劑量在大鼠尾根部皮下注射，空白組大鼠同法注射生理鹽水；初次免疫7 d后再次加強免疫，按100 μg CⅡ ／只的劑量在大鼠尾根部不同部位注射膠原佐劑混合物，空白組大鼠同法注射生理鹽水。

2.3 分組及給藥 大鼠隨機分為空白組、模型組、地塞米松組 （0.5 mg／kg） 及醇提物高劑量 （300 mg／kg， 4.5 g生藥／kg）、 中劑量 （100 mg／kg， 1.5 g 生藥／kg）、 低劑量（30 mg／kg，0.5 g生藥／kg） 組， 每組 10只 ［醇提物單次口服給藥最大耐受量 （MTD）是1 000 mg／kg］。再次免疫后灌胃給藥，每2 d 1次，連續(xù)28 d，其中空白組、模型組給予生理鹽水。

2.4 指標(biāo)檢測 造模第12天開始，測量大鼠左后足腫脹部位周長 （它與給藥前周長的差值作為腫脹度），每隔4 d記錄腫脹情況及體質(zhì)量。末次給藥l h后動脈采血，取血清，－20℃下保存，按照試劑盒操作步驟測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2水平。然后，將大鼠踝關(guān)節(jié)進行福爾馬林固定、脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染色等處理后，顯微鏡 （200倍）下觀察病理改變。

2.5 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分［9］造模后第8天開始，定期觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，每4 d 1次，按5級評分法評價（0分：無紅腫；1分：趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分：趾關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹），關(guān)節(jié)炎指數(shù)為2只后腿積分總和，最高8分。

2.6 IκBα、p65磷酸化水平檢測 采用Western Blot法檢測IκBα、p65磷酸化水平，考察兩者對NF-κB通路是否有調(diào)控作用。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果以 （±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 無尾果醇提物對大鼠體質(zhì)量的影響 圖1顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增幅隨著時間推移逐漸減小；與模型組比較，醇提物組其增幅有不同程度的提高。

圖1 無尾果醇提物對大鼠體質(zhì)量的影響 （n＝10）

3.2 無尾果醇提物對大鼠關(guān)節(jié)的影響 圖2顯示，空白組大鼠踝關(guān)節(jié)無腫脹，各足趾粗細一致，趾間關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)明顯；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)嚴重腫脹，足底厚度明顯增大紅腫，各足趾粗細不一，趾間關(guān)鍵結(jié)構(gòu)不明顯；地塞米松組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕，給藥1周后關(guān)節(jié)紅腫現(xiàn)象基本消失，但整個爪子很瘦；醇提物中、高劑量組大鼠足墊、踝關(guān)節(jié)腫脹程度明顯改善。關(guān)節(jié)炎指數(shù)見圖3。

圖2 各組大鼠足腫脹程度 （n＝10）

圖3 無尾果醇提物對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 （n＝10）

圖4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色 （×200） （n＝10）

圖5 無尾果醇提物對大鼠TNF-α （A）、IL-1β （B）、IL-6（C）、IL-2（D） 水平的影響 （n＝10）

3.3 無尾果醇提物對大鼠組織病理變化的影響 圖4顯示，空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨面完整光滑，滑膜無腫脹；模型組大鼠有明顯的滑膜增生及炎性細胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯；地塞米松組大鼠滑膜較正常，基本無炎性細胞浸潤，關(guān)節(jié)間隙變窄；醇提物高劑量組滑膜較完整，炎性細胞浸潤較少，關(guān)節(jié)軟骨破壞明顯改善；醇劑量組炎性細胞浸潤明顯改善，有少量軟骨破壞；低劑量組滑膜增生不明顯，但軟骨有少量破壞。

3.4 無尾果醇提物對大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2水平的影響 圖5顯示，與模型組比較，醇提物中、高劑量組TNF-α、 IL-1β、 IL-6水平顯著降低 （P＜0.01）， IL-2水平顯著升高 （P＜0.01）。

3.5 無尾果醇提物對大鼠 IκBα、p65磷酸化水平的影響 圖6顯示，與模型組比較，醇提物組IκBα、p65磷酸化水平顯著降低 （P＜0.01）。

圖6 無尾果醇提物對大鼠IκBα、p65磷酸化水平的影響（n＝10）

4 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在藏醫(yī)中稱為 “真布病”，是一種以關(guān)節(jié)病變引起肢體畸形，特別是以關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥、滑膜增生病變及大量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤為主要特征的慢性、全身性、反復(fù)發(fā)作自身免疫性疾?。?0］，其病因尚未完全清楚。隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)飛速發(fā)展，大量資料表明T淋巴細胞、巨噬細胞、增生滑膜細胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中起到主要作用，特別是所產(chǎn)生的促炎細胞因子 （如 IL-1β、 IL-6、 IL-2、 TNF-α 等）［11-14］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，中、高劑量 （100、300 mg／kg）無尾果能明顯降低CIA大鼠足腫脹程度，顯著降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高 IL-2水平，而且可顯著降低 NF-κB通路關(guān)鍵蛋白 p65、IκBα磷酸化水平，推測其作用機制可能與NF-κB通路有關(guān)。雖然無尾果具有顯著的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，今后應(yīng)加強相關(guān)研究，闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機制，為該藏藥和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物合理開發(fā)提供參考。