耿盧婧， 李 岑， 夏政華， 杜玉枝， 魏立新?

（1.中國科學院西北高原生物研究所，藏藥研究重點實驗室，青海 西寧810008；2.中國科學院大學，北京100049；3.青海省藏藥藥理學和安全性評價重點實驗室，青海西寧810008）

藏醫(yī)藥是藏族人民在上千年生活實踐中逐步形成并不斷發(fā)展的傳統(tǒng)醫(yī)藥學，是我國特有的重要醫(yī)藥資源［1］，藏藥中大量使用礦物藥，是我國醫(yī)藥體系中使用最多的［2］。佐太是藏語 “仁青歐曲佐珠欽木”的簡稱，藏醫(yī)認為它是珍寶類藏藥的核心配伍成分，配合其他藥物使用具有減毒增效作用，其炮制過程嚴格且復雜，主要原料為水銀、硫磺、八金灰、八礦灰等［3］，被認為是藏藥中重金屬的主要來源，其安全性一直是人們關注的焦點。

Zhao等［4］對4份不同產(chǎn)地佐太進行X射線光電子能譜分析 （XPS）和X射線衍射 （XRD）研究，發(fā)現(xiàn)其中汞均以硫化汞 （HgS）形式存在；李岑等［5］對不同產(chǎn)地9批佐太中汞的賦存形態(tài)進行分析，驗證了上述結(jié)論，并通過XRD指紋譜圖發(fā)現(xiàn)樣品之間的相似性均大于99.58%；夏振江等［6］用硫氰酸鹽容量法測定青海、四川、甘肅、西藏產(chǎn)13批佐太中HgS含有量，測得其在52.84%～56.23%范圍內(nèi)，平均54.5%。由此可知，不同產(chǎn)地、批次佐太中成分組成和HgS含有量穩(wěn)定性較高。

佐太主要成分為立方晶系硫化汞 （β-HgS）［7-8］， 這與朱砂 （α-HgS 含有量≥98%） 相似，具有鎮(zhèn)定安神、抗驚厥、抗抑郁等作用［9-10］，推測β-HgS可能是其活性成分，但由于人們在生活中往往是 “談汞色變”，故其藥用安全性備受質(zhì)疑。HgS是目前傳統(tǒng)藥物中唯一仍然可以口服的汞化合物形式，其毒性遠小于常見的汞化合物氯化汞（HgCl2） 和甲基汞 （MeHg）， 涉及急性毒性［11］、慢性毒性［12］、 肝毒性［13］、 腎 毒性［14］、 神經(jīng)毒性［15］等各方面。汞的化學存在形式是 HgS或含HgS的傳統(tǒng)藥物與HgCl2、MeHg存在差別的決定性因素［16-17］，但不同化學形態(tài)的汞在毒理、藥理活性方面差異的分子機制仍不清楚。

根據(jù)目前報道可知，佐太可能靶器官為神經(jīng)系統(tǒng)，故本實驗選擇類神經(jīng)細胞——大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12，對佐太可能的神經(jīng)細胞毒性進行探索。同時，在前期研究基礎上采用噻唑藍（MTT）法檢測大劑量佐太、β-HgS、HgCl2對PC12細胞活性的影響，并通過實時熒光定量PCR對凋亡相關基因 （Bcl-2、 Bax、 Bak、 Fas、 FasL）表達進行分析，討論三者作用差異。

1 材料

1.1 儀器 HF-90二氧化碳 （CO2）培養(yǎng)箱 （力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；BCM-1300生物潔凈工作臺 （蘇州蘇潔凈化設備有限公司）；多功能酶標儀 （珀金埃爾默企業(yè)管理上海有限公司）；ETC811基因擴增儀 （蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司）；3K15離心機 （Sigma中國有限公司）；ViiATM7實時熒光定量 PCR儀 ［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］。

1.2 試藥 佐太購自西藏自治區(qū)藏藥公司。β-HgS購自美國 Alfa Aesar公司，含有量不低于98%；HgCl2（分析純）購自貴州省銅仁化學試劑廠，含有量不低于98%。

1.3 細胞與主要試劑 PC12細胞由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、 Penicillin-Streptomycin-Glutamine（100×）， （美國Gibco公司）；蘇木素-伊紅 （HE）染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；MTT（美國Sigma公司）；TRIzol（美國 Ambion公司）；逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量試劑盒 （大連Takara公司）。其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期PC12細胞，胰酶消化后收集細胞，用含10%胎牛血清和1%Penicillin-Streptomycin-Glutamine（100×） 的 RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×104／mL，接種于96孔板 （接種量0.1 mL／孔） 或6孔板 （接種量3 mL／孔）。 在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞鋪滿板底的70%～80%時給藥。

2.2 分組及給藥 細胞隨機分為對照組、佐太組（0.250 g／L，含汞 0.116 g／L）、 β-HgS 組 （0.135 g／L，含汞 0.116 g／L）、 HgCl2組 （0.015 7 g／L， 含汞0.011 6 g／L），為了排除細胞增殖的影響，藥物孵育時間為2 h。其中，佐太組中藥物顆粒的尺度大多在100～600 nm之間，甚至還有部分顆粒小于100 nm［8，18］， 參考其他金屬納米藥物的毒理學研究方法，采用懸浮液給藥［19-20］；β-HgS組劑量為佐太組等汞量，同樣采用懸浮液給藥；由于HgCl2細胞毒性較大，為了保證足夠細胞數(shù)量進行后續(xù)實驗，該組含汞量為佐太組的1／10。

2.3 細胞活性檢測［21］將接種于96孔板中的細胞隨機分組，每組10個復孔，按上述條件進行藥物孵育。孵育結(jié)束后，每孔加入 5 mg／mL MTT（0.1 mol／L磷酸鹽緩沖液 （PBS） 配制，pH 7.2～7.4）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入三聯(lián)液 （含10%SDS、 5% 異丁醇、 10 mmol／L 鹽酸） 150 μL，在37℃CO2培養(yǎng)箱中靜置過夜，于570 nm波長處測定光密度 （OD）值。計算細胞增殖率 （給藥組OD值／對照組OD值×100%）。

2.4 HE染色 在6孔板中制備細胞爬片，按上述條件接種細胞并給藥孵育，孵育結(jié)束后，取出細胞爬片， PBS （0.1 mol／L， pH 7.2～7.4） 漂洗 3 次，95%乙醇固定20 min，蘇木素染色10 min，自來水沖洗分色10 min，伊紅染色30 s，乙醇梯度脫水后中性樹脂封片，光學顯微鏡進行細胞形態(tài)觀察。

2.5 實時熒光定量PCR檢測 按上述條件將6孔板中的細胞隨機分組，并進行給藥處理。藥物孵育結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL TRIzol，按照說明書操作提取細胞總 RNA，測定它在260、280 nm波長處的吸光度及總RNA濃度，根據(jù)2個波長處吸光度的比值 （1.9＜OD260／OD280＜2.0） 和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果評價總RNA質(zhì)量，調(diào)整符合要求的總RNA樣品質(zhì)量濃度至500 ng／μL，應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機引物，按操作指南反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體系見表1，條件為37℃反應15 min，85℃滅活5 s。利用內(nèi)參引物β-actin及凋亡相關基因Bax、Bak、Bcl-2、Fas、FasL的引物對cDNA進行擴增，檢測藥物作用后基因的表達情況，引物序列見表2，實驗體系見表3，PCR實驗條件見表4。重復2次，每次3批，將2次結(jié)果合并后進行分析。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應體系Tab.1 Reverse transcription reaction systems

表2 實時熒光定量PCR引物序列Tab.2 qRT-PCR primer sequences

表3 實時熒光定量PCR反應體系Tab.3 qRT-PCR systems

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0軟件進行處理，置信區(qū)間95%，采用Kolmogorov-Smirnov test檢驗數(shù)據(jù)分布情況，對于呈正態(tài)分布且n≥10的數(shù)據(jù)進行方差分析，并采用Tukey test或Dunnett’s T3 test進行成對比較；對于非正態(tài)分布或n＜10的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis H test進行分析，并采用Mann Whitney U test進行成對分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

表4 實時熒光定量PCR反應條件Tab.4 qRT-PCR reaction conditions

3 結(jié)果

3.1 細胞活性 圖1顯示，佐太組、β-HgS組、HgCl2組 （每組3次實驗）細胞活性趨勢一致，重復性較好，均顯著低于對照組 （P＜0.05）。另外，佐太、β-HgS細胞毒性遠小于HgCl2，兩者作用2 h后細胞活性下降10%左右，而HgCl2的含汞量只有兩者1／10，卻導致其下降70%，表明佐太、HgCl2在細胞毒性方面的差異與其在肝毒性、腎毒性、發(fā)育毒性方面一致［13，22-23］。

注：與對照組比較，?P＜0.05

3.2 細胞形態(tài) 圖2顯示，對照組細胞呈不規(guī)則多邊形或梭型；佐太組細胞膜邊緣粗糙，出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，表明佐太對細胞膜的完整性產(chǎn)生一定破壞；β-HgS組細胞質(zhì)部分體積變大，但細胞結(jié)構(gòu)仍保持完整，推測 β-HgS可能引起細胞滲透壓失衡；HgCl2組細胞膜幾乎完全被裂解，細胞核凝集，與HgCl2引起Kidney OK細胞凋亡時的形態(tài)特征一致［24］。由此可知，HgCl2對細胞形態(tài)的影響遠高于佐太和β-HgS，與 “3.1”項下結(jié)果一致。

圖2 各組細胞HE染色 （×400）Fig.2 HE staining of cells in various groups（×400）

3.3 線粒體相關凋亡基因 本實驗選擇Bcl-2、Bax、Bak檢測藥物對線粒體凋亡通路的影響。Bcl-2家族的蛋白通過控制線粒體膜透性調(diào)節(jié)細胞凋亡［25］，其中Bcl-2是第一個被確認具有抑制作用的基因，其高表達能阻止多種凋亡誘導因素 （如電離輻射、化學藥物等）所引發(fā)的細胞凋亡；Bax、Bcl-2具有大約1／5的同源性，但兩者相互拮抗，具有促進細胞凋亡的作用［26］；Bak與Bcl-2的同源性為25%，但與Bax一樣也具有促細胞凋亡的作用［27］。

圖3顯示，與對照組比較，佐太組Bax、Bak、Bcl-2表達顯著下降 （P＜0.05）， β-HgS組 Bax、Bak表達顯著下降 （P＜0.05），HgCl2組僅Bcl-2表達顯著下降 （P＜0.05）。由此可知，佐太和β-HgS可能對促凋亡基因Bax、Bak引起的細胞凋亡有抑制作用，而HgCl2可抑制抗凋亡基因Bcl-2表達。

圖3 佐太、β-HgS、HgCl2對 Bax、Bak、Bcl-2 mRNA表達的影響Fig.3 Effects of Zuotai， β-HgS and HgCl2on Bax， Bak，Bcl-2 mRNA expressions

3.4 死亡受體相關凋亡基因 細胞膜表面死亡受體及其配體 （Fas／FasL）是細胞凋亡主要途徑之一，也是近年來認識較為深入的與細胞凋亡信號傳遞有關的分子系統(tǒng)［28-29］。細胞膜表面死亡受體Fas基因又稱Apo-1或CD95，屬于腫瘤壞死因子受體／神經(jīng)生長因子受體超家族 （TNFR／NGFR）；FasL又稱CD95L，是Fas天然配體，屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族的細胞因子，兩者可反映藥物對死亡受體凋亡通路的影響。

圖4顯示，與對照組比較，佐太組FasL表達顯著降低 （P＜0.05）， β-HgS組Fas、FasL表達顯著降低 （P＜0.05），HgCl2組兩者表達顯著升高（P＜0.05）。 由此可知， HgCl2可能通過 Fas／FasL途徑誘導細胞凋亡，而佐太和β-HgS對Fas／FasL通路有一定抑制作用。

4 討論

圖4 佐太、β-HgS、HgCl2對Fas、FasL mRNA表達的影響Fig.4 Effects of Zuotai， β-HgS and HgCl2on Fas， FasL mRNA expressions

本實驗發(fā)現(xiàn)，佐太、β-HgS對PC12細胞的毒性遠小于HgCl2，并可抑制促凋亡基因Bax、Bak信號傳導和Fas／FasL凋亡通路激活；HgCl2可抑制抗凋亡基因Bcl-2表達，并激活Fas／FasL通路，由此揭示了佐太、β-HgS與HgCl2在細胞毒性分子機制方面差異，也表明其激活的信號通路有根本差別。同時，佐太、β-HgS對PC12細胞活性的影響程度很接近，但實時熒光定量PCR的結(jié)果并不完全相同，前者對線粒體凋亡相關基因 （Bcl-2、Bax、Bak）的影響高于后者，但對死亡受體基因（Fas、FasL）表達的影響又弱于后者，推測β-HgS可能不是佐太中的唯一活性成分。

然而，細胞活性實驗結(jié)果和實時熒光定量PCR結(jié)果并不一致。佐太、β-HgS并未表現(xiàn)出明顯的對細胞不利的調(diào)節(jié)作用，但兩者確實對細胞活性造成一定損傷，這是因為本實驗只檢測5個基因（Bcl-2、 Bax、 Bak、 Fas、 FasL） 表達差異， 不能代表藥物對機體的全部影響，故對佐太、β-HgS、HgCl2產(chǎn)生細胞毒性的信號通路還需要進一步深入探索。

綜上所述，佐太、β-HgS對PC12細胞的毒性遠小于HgCl2，兩者可能會引起促凋亡基因Bax、Bak和死亡受體 Fas／FasL通路的信號傳導阻滯，而HgCl2可能通過抑制抗凋亡基因Bcl-2表達、激活Fas／FasL通路來引起細胞凋亡，這可為研究佐太等含汞藥物的藥理活性、毒理作用提供新思路。