張二飛， 殷 紫， 閆宇輝， 錢 俊， 韓永紅

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇淮安223003）

阿爾茨海默病是一種神經(jīng)退行性病變，為老年癡呆最常見的類型，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能喪失、記憶功能障礙等［1-3］，主要病理特征為β-淀粉樣蛋白過度沉積形成的細(xì)胞外老年斑、Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失［4］，發(fā)病機制假說主要包括β淀粉樣蛋白假說、Tau蛋白假說、炎癥假說、氧化應(yīng)激假說等［5-7］。

楮實子功效補腎清肝、明目、利尿，用于肝腎不足、腰膝酸軟、虛勞骨蒸、頭暈?zāi)炕琛⒛可枘?、水腫脹滿，具有一定神經(jīng)保護(hù)作用，能提高大鼠慢性腦供血不足后認(rèn)知功能障礙，其水煎劑能通過調(diào)控MAPK通路改善D-半乳糖所致PC12細(xì)胞凋亡［8-12］，但尚無對阿爾茨海默病模型的神經(jīng)保護(hù)作用及機制尚未見報道。因此，本實驗探討楮實子對APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF級8月齡C57BL／6雄性小鼠，購于遼寧長生生物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （遼） 2013-0001；8月齡 APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，購于北京中科澤晟生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2013-0002，體質(zhì)量 （30±3）g，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫20～25℃，相對濕度40%～60%，每天光照12 h，采用PCR法鑒定，選取陽性小鼠用于實驗。

1.2 試藥 楮實子購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院祝冬青副教授鑒定為正品。多奈哌齊 （批號664081，美國Sigma公司）。TUNEL試劑盒 （南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；BrdU （美國 Sigma公司）；小鼠抗 BrdU、GSK-3β， 兔抗 NeuN、 β-catenin、 β-actin抗體 （北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；羊抗小鼠FITC、驢抗兔Cy3標(biāo)記二抗 （美國Jackson公司）；辣根過氧化物酶 （HRP）、標(biāo)記羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記驢抗兔IgG（北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；全蛋白提取、BCA蛋白定量試劑盒 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 CM1850冰凍切片機、DMLS2顯微鏡、DFC500照相系統(tǒng) （德國徠卡公司）；MS-1水迷宮儀 （成都儀器廠）；水平核酸電泳儀、半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀 （美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 分組 將40只APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組、陽性藥組 （10 mg／kg多奈哌齊）及楮實子低、 高劑量組 （1.8、 3.6 g／kg）， C57BL／6小鼠作為對照組，每組10只。

2.2 給藥 50 g楮實子用蒸餾水浸泡1 h后煎煮2次，每次2 h，合并藥液，濃縮至100 mL，終質(zhì)量濃度為0.5 g／mL（生藥量），小鼠灌胃給藥，同時陽性藥組小鼠灌胃給予10 mg／kg多奈哌齊，對照組小鼠灌胃給予同體積的蒸餾水，連續(xù)6周。

2.3 Morris水迷宮實驗 經(jīng)過6周給藥后，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。檢測儀器由1個圓桶 （直徑120 cm、高60 cm）、攝像及自動圖像采集分析系統(tǒng)組成，桶內(nèi)分成4個象限，逃生平臺 （直徑10 cm）置于其中1個象限內(nèi)，加水 （水溫25℃）至水面高于平臺2 cm，觀察小鼠尋找臺面所需時間及穿越平臺次數(shù)。

2.4 原位末端標(biāo)記 （TUNEL）法 小鼠給藥后處死取腦，制備冰凍切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作步驟檢測海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

2.5 免疫熒光染色 將5 μm腦冰凍冠狀切片于室溫下晾干，固定、透化、封閉后兔抗NeuN、鼠抗BrdU抗體（1∶150）4℃下孵育過夜，次日滴加羊抗小鼠 Cy3標(biāo)記、驢抗兔 FITC標(biāo)記二抗（1∶200）室溫孵育1 h，DAPI染核，蓋玻片封片，置于熒光顯微鏡下觀察NeuN／BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)。

2.6 Western Blot法 小鼠麻醉后進(jìn)行心臟灌流，取海馬區(qū)腦組織，研磨，經(jīng)蛋白提取、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色后凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，測定光密度，其中GSK-3β、β-catenin、β-actin抗體稀釋濃度分別為1∶800、1∶600、1∶1 000，HRP標(biāo)記二抗稀釋濃度為1∶800。然后，以目的條帶、內(nèi)參蛋白條帶光密度比值為指標(biāo)進(jìn)行分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以 （±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 楮實子對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 圖1A顯示，與對照組比較，模型組小鼠潛伏期顯著延長（P＜0.01）；與模型組比較，楮實子高劑量組其潛伏期顯著縮短 （P＜0.05）。圖1B顯示，與對照組比較，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較，楮實子高劑量組其次數(shù)顯著增加 （P＜0.05）。

3.2 楮實子對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 圖2顯示，與對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加 （P＜0.01）；與模型組比較，楮實子高劑量組其數(shù)量顯著降低 （P＜0.01）。

圖1 楮實子對小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響Fig.1 Effects of Broussonetiae Fructus on mouse learning and memory activities

圖2 楮實子對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Broussonetiae Fructus on nerve cell apoptosis in mouse hippocampal area

3.3 楮實子對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響 圖3顯示，與對照組比較，模型組小鼠海馬新生神經(jīng)元數(shù)顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較，楮實子高劑量組其數(shù)量顯著增加 （P＜0.01）。

圖3 楮實子對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的影響Fig.3 Effect of Broussonetiae Fructus on neurogenesis in mouse hippocampal area

3.4 楮實子對GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)的影響

圖4顯示，與對照組比較，模型組GSK-3β蛋白表達(dá)顯著升高，β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較，楮實子高劑量組GSK-3β蛋白表達(dá)顯著降低，β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

阿爾茨海默病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為患者生活能力下降、記憶力減退，并出現(xiàn)神經(jīng)行為異常、認(rèn)知功能障礙，甚至生活不能自理，隨著老齡化加劇，患病人數(shù)將保持快速增長，預(yù)計到2030年全世界患者將達(dá)到6 500萬左右，將會對全社會造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)［13］。

神經(jīng)干細(xì)胞在一定條件下可分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，參與神經(jīng)功能維持、修復(fù)等過程，稱為神經(jīng)發(fā)生［14-15］。成年哺乳動物海馬區(qū)仍然具有神經(jīng)發(fā)生的能力，打破了中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不能再生的觀點，也是阿爾茨海默病患者最易受損的區(qū)域之一，它主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶功能，故患者在早期均會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙［16-17］。

圖4 楮實子對GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Broussonetiae Fructus on GSK-3β，β-catenin protein expressions

APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是公認(rèn)的阿爾茨海默病動物模型之一［18］，可表達(dá)突變的人類早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉樣前體蛋白 （APPswe）融合體，人類早老素基因的第9個外顯子突變?nèi)笔?dǎo)致早發(fā)性老年癡呆癥［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)，高劑量（3.6 g／kg） 楮實子能顯著改善APP／PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。研究表明，在阿爾茨海默病發(fā)生時，Aβ大量沉積，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元大量凋亡和丟失，從而引起海馬神經(jīng)發(fā)生障礙。利用TUNEL法和NeuN／BrdU免疫熒光染色檢測小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)元新生情況，發(fā)現(xiàn)模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增多，新生神經(jīng)元數(shù)顯著降低 （P＜0.01），而給予高劑量 （3.6 g／kg） 楮實子后海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著減少 （P＜0.01），新生神經(jīng)元數(shù)也顯著增加 （P＜0.01），表明它能促進(jìn) APP／PS1小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生。

Wnt／β-catenin信號通路是影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和神經(jīng)元凋亡最重要的通路之一，當(dāng)通路激活時可引起GSK-3β表達(dá)下降，β-catenin水平升高［20］。 研究表明， 激活 Wnt／β-catenin 信號通路能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，刺激其分化為神經(jīng)元，并能減少神經(jīng)元的凋亡，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元再生中起重要作用［21-23］。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)顯著升高，β-catenin蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.01），而給予高劑量（3.6 g／kg）楮實子后 β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高，GSK-3β蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.05），表明它能減少神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，在一定程度上與激活可Wnt／β-catenin信號通路。

綜上所述，楮實子可減少阿爾茨海默病小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，改善學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與激活 Wnt／β-catenin信號通路有關(guān)。