孔 燕， 王 健

（揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇揚(yáng)州225009）

益氣通脈膠囊為寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)方，由西洋參、三七、黃精、川芎、赤芍等8味藥材組成，功效益氣養(yǎng)陰、活血通脈，用于氣陰不足兼血瘀癥所致頭昏、頭暈、胸悶、胸痛，但該方并無(wú)明確詳細(xì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和反復(fù)摸索，制定三七、川芎的顯微鑒別方法，確定川芎、赤芍、西洋參、三七的TLC定性鑒別方法［1］，并通過(guò)HPLC法測(cè)定西洋參、三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含有量［2］， 以期控制該制劑質(zhì)量［3］。

1 材料

BX51光學(xué)顯微鏡、3X Optical Zoom數(shù)碼相機(jī)（日本 Olympus公司）；MS204S電子天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州國(guó)華電器有限公司）；TLC Visualizer薄層成像系統(tǒng) （瑞士Camag公司）；硅膠G薄層板、高效硅膠G薄層板 （青島海洋化工廠）；Agilent 1200高效液相色譜儀 （美國(guó)安捷倫公司）。乙腈為色譜純［4］；其他試劑均為分析純；水為純化水。

川芎 （批號(hào)120918-201612）對(duì)照藥材及芍藥苷 （批號(hào) 110736-201741）、 三七皂苷 R1（批號(hào)110745-201619）、 人參皂苷 Rg1（批號(hào) 110703-201731）、人參皂苷Re（批號(hào)110754-201626）、人參皂苷 Rb1（批號(hào)110704-201625）、擬人參皂苷（批號(hào)841-9903）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

3批益氣通脈膠囊來(lái)自寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院制劑室， 批號(hào)170502、 170529、 170619， 0.3 g／粒， 10粒／板，3板／盒。缺川芎、赤芍、西洋參、三七陰性樣品 （同時(shí)缺西洋參、三七的為陰性對(duì)照），來(lái)自寶應(yīng)縣中醫(yī)醫(yī)院制劑室。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 圖1～2顯示，三七中樹脂道碎片含黃色分泌物［7］；川芎中油室大多已破碎，偶可見(jiàn)油室碎片，分泌細(xì)胞壁薄，含有較多的油滴［7］，3批樣品顯微特征均穩(wěn)定，易于鑒別。

圖1 三七顯微鑒別圖Fig.1 Image for microscopic identification of Notoginseng Radix et Rhizoma

2.2 TLC定性鑒別

2.2.1 川芎 取本品內(nèi)容物2 g，加25 mL乙醚輕搖，回流15 min，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)? mL乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液［8-9］；取對(duì)照藥材1 g，同法制成相應(yīng)溶液［3，7］；取陰性樣品適量，同法制成相應(yīng)溶液，吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅 膠 G 薄 層 板 上［6，10］， 以 正 己 烷-乙 酸 乙 酯（3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)缸中預(yù)平衡15 min，上行展開(kāi)，展距 9 cm，取出，晾干，置于紫外燈（365 nm） 下檢視［4，11］， 結(jié)果見(jiàn)圖 3。 由圖可知，供試品色譜中在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)［12］， 陰性無(wú)干擾［13］。

圖2 川芎顯微鑒別圖Fig.2 Image for microscopic identification of Chuanxiong Rhizoma

圖3 川芎TLC色譜圖Fig.3 TLC chromatogram of Chuanxiong Rhizoma

2.2.2 赤芍 取本品內(nèi)容物2 g，加25 mL乙醇，輕搖，超聲15 min，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)? mL乙醇溶解，作為供試品溶液［4］；取芍藥苷對(duì)照品適量，甲醇制成每1 mL含1 mg該成分的對(duì)照品溶液［2］；取陰性樣品適量，同法制成相應(yīng)溶液，吸取上述3種溶液各8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上［2］， 以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （40 ∶5 ∶20 ∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)缸中預(yù)平衡15 min，上行展開(kāi)，展距9 cm，取出，晾干，再噴以5%香草醛硫酸溶液［7-8］， 105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［11］， 置于日光下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，供試品色譜在與對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)［2］，陰性無(wú)干擾。

2.2.3 西洋參、三七 取本品內(nèi)容物2 g，加25 mL甲醇輕搖，回流30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，加水飽和正丁醇振搖提取2次［5］， 每次 25 mL， 合并提取液［14-15］， 正丁醇飽和水洗滌 2 次［2-3］， 每次 10 mL， 分取正丁醇液［7，9］，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液［4，8］； 取擬人參皂苷 F11、 人參皂苷 Rb1、 人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對(duì)照品適量，甲醇制成每l mL各含2 mg上述成分的對(duì)照品溶液；取陰性對(duì)照適量，同法制成相應(yīng)溶液，吸取上述3種溶液各 5 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上［4，11］， 以三氯甲烷-無(wú)水乙醇-水 （20 ∶20 ∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)缸中預(yù)平衡15 min，上行展開(kāi)，展距9 cm，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液［11］， 105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［4，15］， 分別置于日光、紫外光燈 （365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，供試品色譜在與對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)［2，10］，陰性無(wú)干擾。

2.3 HPLC含有量測(cè)定

2.3.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Inertsil?ODS-SP 色譜柱 （5 μm， 4.6 mm×250 mm）； 流動(dòng)相乙腈 （A）-水 （B）， 梯度洗脫， 程序見(jiàn)表 1；體積流量 1.0 mL／min；柱溫 28℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見(jiàn)圖6。由圖可知，各成分分離度良好，陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb1計(jì)應(yīng)不低于4 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

圖5 三七、西洋參TLC色譜圖Fig.5 TLC chromatograms of Notoginseng Radix et Rhizoma and Panacis quinquefolii Radix

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制成分別含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、 人 參 皂 苷 Rb1317.12、 552.32、 646.72、561.28 μg／mL 的溶液， 即得。

2.3.2.2 供試品溶液 取質(zhì)量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，精密稱取約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，靜置1 h，80℃水浴回流2 h，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5、6 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度， 分別精密量取 10 μL［4］， 在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定［10］。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）， 峰面積為縱坐標(biāo) （Y）［16］進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖6 各成分HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

然后，甲醇多次稀釋對(duì)照品溶液，以信噪比S／N＝3為檢測(cè)限，S／N＝10為定量限。結(jié)果，三七皂苷R1檢測(cè)限、 定量限分別為 2.448、 8.606 μg／mL，人參皂苷Rg1分別為0.628、 3.580 μg／mL， 人參皂苷 Re 分別為 3.720、 13.953 μg／mL、 人參皂苷Rb1分別為 0.102、 27.151 μg／mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液各10 μL， 在 “2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定 6次［16］， 測(cè)得三七皂苷 R1、 人參皂苷 Rg1、 人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD［17］分別為1.4%、1.2%、1.2%、0.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)170502樣品0.5 g，按 “2.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、 4、 8、 12、 24、 48 h在 “2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定［18］，測(cè)得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為1.6%、1.5%、1.5%、0.9%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)170502樣品6份，每份0.5 g，按 “2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定［19］，測(cè)得三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷Rb1含有量RSD分別為1.4%、1.5%、13%、0.8%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取批號(hào)170529樣品6份，每份0.25 g，精密加入含三七皂苷 R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb11 982、4 054、 3 564、 3 784 μg／mL 的對(duì)照品溶液 0.2 mL及甲醇24.8 mL，按 “2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.3.8 樣品含有量測(cè)定 將 3批樣品［13］按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定［9］，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表4。然后，按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均含有量的80%設(shè)限，分別為0.30、1.60、1.30、3.00 mg／粒，擬規(guī)定樣品中［5，18］含西洋參、三七量以各成分總含有量計(jì)，不得少于6.0 mg／粒。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 討論

3.1 TLC條件篩選 川芎的TLC條件參照2015年版 《中國(guó)藥典》，采用乙醚回流提取作為提取方法；比較了硅膠G預(yù)制薄層板、硅膠H預(yù)制薄層板、高效硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠）上，發(fā)現(xiàn)高效硅膠G板雖然斑點(diǎn)較清晰，但Rf值相對(duì)其他2種板稍遜，綜合考慮選擇硅膠G板作為點(diǎn)樣薄層板；考察了不同展開(kāi)系統(tǒng)，最終采用正己烷-乙酸乙酯 （3∶1），此時(shí)斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值適宜； 比較了點(diǎn)樣2、5、 8、10 μL， 發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣5 μL時(shí)斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，分離度良好，無(wú)拖尾現(xiàn)象；樣品放置24 h后再點(diǎn)樣，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)仍清晰可見(jiàn)，表明穩(wěn)定性較好；溫度、濕度對(duì)川芎TLC定性鑒別的影響不顯著，兩者分別在15～22℃、38%～65%范圍內(nèi)時(shí)薄層層析結(jié)果穩(wěn)定，斑點(diǎn)清晰。

赤芍的TLC條件參照2015年版 《中國(guó)藥典》，采用乙醇超聲作為提取方法；比較了硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠、德國(guó)MN公司）、高效硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠），發(fā)現(xiàn)均能得到較好分離，主斑點(diǎn)清晰，其中MN硅膠G板的斑點(diǎn)清晰度優(yōu)于青島海洋硅膠G板，但Rf值較低，而后者雖然斑點(diǎn)略散，但Rf值較適中，故選擇青島海洋硅膠G板作為點(diǎn)樣薄層板；比較了不同展開(kāi)系統(tǒng)，最終采用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶20∶0.5），此時(shí)斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值適宜； 比較了點(diǎn)樣2、5、8、10 μL， 發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣8 μL斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，分離度良好，無(wú)拖尾現(xiàn)象；樣品放置24 h后點(diǎn)樣，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)仍清晰可見(jiàn)，表明穩(wěn)定性較好；溫度、濕度對(duì)赤芍TLC定性鑒別的影響不顯著，兩者分別在15～22℃、38%～65%范圍內(nèi)時(shí)薄層層析結(jié)果穩(wěn)定，斑點(diǎn)清晰。

西洋參、三七的TLC條件參考了2015年版《中國(guó)藥典》，由于前者含有擬人參皂苷F11，為其特異性成分，同時(shí)2種藥材中共有成分較多，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1相對(duì)含有量較高，故選擇上述5種成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；考察了不同提取方法，最終采用甲醇回流蒸干→加水溶解→正丁醇萃取→水洗作為提取方法；比較了硅膠G預(yù)制薄層板、硅膠H預(yù)制薄層板、高效硅膠G預(yù)制薄層板 （青島海洋化工廠），發(fā)現(xiàn)對(duì)照品在硅膠G、硅膠H板上均不能完全分離，而在高效硅膠G板上有較好分離，主斑點(diǎn)清晰，故選擇其作為點(diǎn)樣薄層板；比較了不同展開(kāi)系統(tǒng)，最終采用三氯甲烷-無(wú)水乙醇-水 （20∶20∶2）；比較了點(diǎn)樣2、 5、 8、 10 μL， 發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣 5 μL時(shí)斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，分離度良好，無(wú)拖尾現(xiàn)象；樣品放置24 h后點(diǎn)樣，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)然清晰可見(jiàn)，表明穩(wěn)定性較好。溫度、濕度對(duì)人參皂苷類成分TLC定性鑒別的影響較大，兩者分別在20℃以下、低于50%時(shí)薄層層析結(jié)果穩(wěn)定，斑點(diǎn)清晰。

3.2 HPLC條件篩選 參考2015年版 《中國(guó)藥典》，分別放置過(guò)夜、1 h后再回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯區(qū)別，故確定提取方法為取樣后加甲醇靜置1 h，80℃水浴下回流2 h，此時(shí)供試品溶液提取充分，簡(jiǎn)便易行；以出峰數(shù)、相鄰對(duì)照品色譜峰之間的分離度為主要指標(biāo)，優(yōu)化色譜柱、柱溫、流動(dòng)相、梯度洗脫程序、檢測(cè)波長(zhǎng)，最終確定“2.3.1” 項(xiàng)下色譜條件［20］。