尹志輝 付學(xué)源 成立祥

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院肛腸科，衡陽 421001)

結(jié)直腸癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤，其高發(fā)病率和高致死率對人們的生存、生活質(zhì)量造成了嚴重威脅[1]。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，結(jié)直腸癌在全球范圍內(nèi)每年新增病例約100萬，大約有2/3患者接受手術(shù)進行根治性治療，但在5年內(nèi)仍有超過1/3患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，僅美國每年約50 000人因此腫瘤而致死[2]。在我國，隨著人民生活方式和生產(chǎn)環(huán)境的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率在明顯上升[3]。盡管近幾年結(jié)直腸癌的治療手段取得了一些進展，但中晚期患者的生存率并沒有得到提高，因此對結(jié)直腸癌的早期診斷及患者預(yù)后的研究，對該病的防治具有重要的現(xiàn)實意義。

核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(Nuclear transcription factor kappaB,NF-κB)是Rel家族的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB被激活后能控制目的基因，通過抑制NF-κB的活性則盡可能地抑制癌細胞的生長及促進癌細胞的凋亡[4]；Notch信號通路是機體內(nèi)最重要信號通路之一 ,在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和控制細胞命運方面起著重要作用。正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細胞正常增殖和分化、器官和組織的再生，當(dāng)異常信號發(fā)生時，細胞增殖增加，可以進一步轉(zhuǎn)化為癌[5]；細胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白-1(Suppressor of Cytokine Signaling,SOCS-1)是最先發(fā)現(xiàn)的負性調(diào)節(jié)因子,它可抑制多種細胞因子的信號傳導(dǎo)，如促生長素(Growth hormone,GH)、白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)、抑瘤素M(Oncostatin-M,OSM)、干擾素γ(Interferon-γ,INF-γ)和白介素-2(Interleukin-2,IL-2)等，其中還包括對NF-κB活性的抑制調(diào)節(jié)作用。SOCS蛋白具有調(diào)節(jié)細胞因子、控制細胞分化、阻斷增強的細胞因子效應(yīng),與自身免疫、超敏反應(yīng)和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[6]。本研究采用免疫組化法和Western blot法檢測結(jié)直腸癌組織中NF-κB、Notch-1和SOCS-1的表達，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 本實驗收集2016年11月～2017年12月我院結(jié)直腸癌根治術(shù)后的標本55例(均具備完整臨床資料且經(jīng)病理證實)，包括32例男性，23例女性，年齡24～83歲，其中結(jié)腸癌26例，直腸癌29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴轉(zhuǎn)移18例；高分化和中分化癌20例，低分化和未分化癌35例，術(shù)前均未進行放化療。另取30例癌旁正常大腸黏膜組織做對照組。用于免疫組化(SP)檢測的標本經(jīng)福爾馬林溶液(100 mmol/L)固定，常規(guī)石蠟包埋，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱。用于Western blot檢測的標本在術(shù)中組織切除后立即液氮凍存，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱。

1.1.2Western blot實驗試劑 小鼠抗人Notch1單克隆抗體(濃縮型)、兔抗人NF-κB多克隆抗體(濃縮型)、兔抗人SOCS-1 多克隆抗體(濃縮型)、兔抗β-actin多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PVDF膜(美國Milipore公司)，考馬斯亮藍試劑盒(南京建成生物試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1NF-κB、Notch-1和SOCS-1表達檢測 免疫組化實驗：采用SP兩步法。小鼠抗人Notch1單克隆抗體(濃縮型)、兔抗人NF-κB多克隆抗體(濃縮型)、兔抗人SOCS-1 多克隆抗體(濃縮型)、SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新公司。SP免疫組化染色操作嚴格按照說明書進行，每次染色均設(shè)陽性對照(陽性標本)及陰性對照(PBS代替一抗)。Western blot實驗：取-80℃冰箱中新鮮結(jié)腸癌組織提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，放入含5%脫脂奶粉的TBST進行封閉，37℃保溫箱90 min；在裝有一抗封閉液的雜交袋中過夜，采用TBST液洗膜5次，每次8 min；加二抗封閉液封閉PVDF膜，37℃孵育2 h后曝光，觀察結(jié)果。采用Lab Works 4.5分析系統(tǒng)軟件(美國UVP公司)對Western blot條帶進行定量分析，各組目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白條帶的A值/內(nèi)參蛋白(β-actin)的A值。

1.2.2結(jié)果判定 每例切片選取5個具有代表性的高倍(×400倍)視野，計數(shù)1 000個腫瘤細胞中陽性細胞的百分比，并評估染色強度。染色強度高于背景的非特異性染色判定陽性細胞，均值表達率>20%的細胞數(shù)為陽性表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，組間比較采用t檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫組化檢測NF-κB、Notch-1和SOCS-1在結(jié)直腸癌組織中的表達 NF-κB蛋白和Notch-1蛋白在細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達，結(jié)直腸癌組織中陽性表達率分別為63.64%、65.45%，明顯高于其在正常大腸黏膜組織中的表達率13.33%、10.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；SOCS-1蛋白表達于細胞質(zhì)，正常大腸黏膜組織中的陽性表達率73.3%，明顯高于其在結(jié)直腸癌組織中的表達率23.64%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 NF-κB、Notch-1和SOCS-1蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達Tab.1 Expression of NF-κB,Notch-1 and SOCS-1 protein in colorectal cancer(CRC)tissues and normal tissues adjacent to cancer

圖1 結(jié)直腸癌組織和正常大腸黏膜組織中NF-κB、Notch-1和SOCS-1的表達Fig.1 Expression of NF-κB,Notch-1 and SOCS-1 in colorectal cancer tissues and normal colorectal mucosa tissuesNote: Figure A,C and E represent the expression of NF-κB,Notch-1 and SOCS-1 in normal colorectal mucosa,respectively(SP×400)；Figure B,D and F represent the expression of NF-κB,Notch-1 and SOCS-1 in the CRC tissues,respectively(SP×400).

2.2NF-κB、Notch-1和SOCS-1的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系 由表2可知，NF-κB、Notch-1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及分化程度有關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤所在部位無關(guān)(P>0.05)：NF-κB在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未浸潤漿膜及高中分化的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率分別為27.78%、38.10%、35.0%，明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤漿膜及低分化的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率78.38%、85.29%、85.71%；Notch-1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未浸潤漿膜及高中分化的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率分別為33.33%、38.10%、40.0%，明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤漿膜及低分化的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率81.08%、76.47%、88.57%。SOCS-1蛋白的表達與分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)(P>0.05)：SOCS-1在高中分化的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率為55.0%，明顯高于低分化的結(jié)直腸癌組織中陽性表達率為11.43%。

圖2 NF-κB、Notch-1和SOCS-1Western blot檢測結(jié)果Fig.2 Expression of NF-κB，Notch-1 and SOCS-1 detected by Western blot

表2 NF-κB、Notch-1和SOCS-1的表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of NF-κB,Notch-1,SOCS-1 and clinicopathological factors in CRC

表3 在結(jié)直腸癌中NF-κB、Notch-1和SOCS-1表達的相關(guān)性分析Tab.3 Analysis of correlation about expression among NF-κB，Notch-1 and SOCS-1 in CRC

2.3NF-κB、Notch-1和SOCS-1在結(jié)直腸癌組織中Western blot檢測結(jié)果 NF-κB、Notch-1蛋白在正常大腸黏膜組織中的相對表達強度分別為24.001 2±17.05和27.995 5±9.98，明顯低于在結(jié)腸癌組織中的相對表達強度70.112 3±13.92和88.543 4±16.44，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-10.001，P<0.05；t=-13.012，P<0.05)。SOCS-1蛋白在正常大腸黏膜組織的相對表達強度為37.521 3±7.87，高于結(jié)腸癌組織中蛋白相對表達強度11.996 7±4.56，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-12.005，P<0.05)。見圖2。

2.4NF-κB、Notch-1和SOCS-1在結(jié)直腸癌表達中的相互關(guān)系 由表3可知，在55例結(jié)直腸癌中，NF-κB與Notch-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.789，P<0.01)，NF-κB與SOCS-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達呈負相關(guān)(r=-0.367，P<0.01)，Notch-1與SOCS-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈負相關(guān)(r=-0.411，P<0.01)。

3 討論

目前我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，早期結(jié)直腸癌多無特異性臨床表現(xiàn)，往往發(fā)現(xiàn)時已屬于中晚期，患者最終多因腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生死亡。因此，及時發(fā)現(xiàn)并判斷腫瘤病變程度對治療方案具有相當(dāng)重要的臨床意義。近年來，隨著分子生物學(xué)在腫瘤研究領(lǐng)域的進展，腫瘤的形成機制被進一步揭示，為腫瘤治療提供了新的思路。

NF-κB存在于體內(nèi)多種細胞中，發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用，在不依賴外界刺激的情況下，腫瘤細胞本身也存在炎性信號通路的異常激活。NF-κB信號通路的激活能促進炎癥因子、趨化因子、黏附分子、生長因子等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。有研究表明在炎癥存在的情況下，NF-κB持續(xù)表達會引起腸黏膜細胞過度增生[8]。本研究的免疫組化檢測結(jié)果顯示，NF-κB蛋白在細胞膜和細胞質(zhì)中均有表達，結(jié)直腸癌組織中陽性表達率明顯高于其在正常大腸黏膜組織中的表達；Western blot檢測結(jié)果顯示在正常大腸黏膜組織中NF-κB的表達低于其在結(jié)直腸癌組織中的表達(P<0.05)；NF-κB在結(jié)直腸癌中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤漿膜及分化程度有關(guān)(P<0.01)，這提示高表達的NF-κB與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。同時Notch-1和NF-κB的相關(guān)性分析可知，NF-κB與Notch-1呈顯著正相關(guān)，可能機制為Notch-1基因中的NF-κB結(jié)合位點與活化的 NF-κB結(jié)合，從而激活NF-κB高表達。

Notch-1是Notch在人體4種受體中的一種，Notch-1在細胞分化中起著核心作用，不僅維持干細胞的數(shù)量，也決定著細胞的分化命運[9]。持續(xù)的Notch-1活化能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的衰老，促使其表達趨化因子以及黏附因子，從而進一步促進嗜中性粒細胞的浸潤及腫瘤細胞在內(nèi)皮上的黏附、滲透、在肺部的聚集，以及術(shù)后轉(zhuǎn)移等[10]。本研究免疫組化檢測結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌組織中Notch-1蛋白陽性表達率較正常大腸黏膜組織中的表達上升(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果顯示，正常大腸黏膜組織中Notch-1在的表達明顯低于其在結(jié)直腸癌組織中的表達(P<0.05)；結(jié)直腸癌中Notch-1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤漿膜及分化程度有關(guān)(P<0.01)。我們在研究Notch 信號通路中發(fā)現(xiàn)NF-κB是其下游信號的重要分子，Notch 信號通路與NF-κB之間的多重交互和相互作用對結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。文獻報道NF-κB與Notch-1表達呈正相關(guān)，二者在結(jié)腸癌中相互作用并參與其發(fā)病過程[11]，這提示我們對結(jié)直腸癌的研究能以Notch或NF-κB為靶點進行基因治療以及新藥開發(fā)。

SOCS-1是SOCS家族中目前研究較深入的新型抑癌基因，研究提示SOCS-1能夠介導(dǎo)體外和體內(nèi)過敏性炎癥，同時在調(diào)節(jié)過程中參與癌細胞、肥大細胞和巨噬細胞的細胞間的相互作用[12]。目前國內(nèi)外的研究報道了SOCS-1蛋白在胰腺癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌、肝癌中的低表達[13]，而其在大腸癌中的研究表達情況甚少。本研究免疫組化結(jié)果顯示，正常大腸黏膜組織中SOCS-1的表達率明顯高于其在結(jié)直腸癌組織中的表達(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果顯示在正常大腸黏膜組織中的SOCS-1蛋白表達高于結(jié)直腸癌組織中蛋白表達(P<0.05)；SOCS-1在結(jié)直腸癌中的表達僅與分化程度有關(guān)(P<0.01)，這說明SOCS-1的低表達參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，實驗結(jié)果與目前觀點一致[14]。此外，結(jié)直腸癌中 SOCS-1 的表達與 NF-κB、Notch-1的表達均呈負相關(guān)，有文獻報道結(jié)直腸癌中SOCS-1 表達不足對IκB 的磷酸化起到上調(diào)作用[15]，激活處于非活化狀態(tài)的NF-κB多聚體，上調(diào)其表達而致癌，而NF-κB 和Notch-1表達呈正相關(guān)性，因此可能對Notch-1表達也會產(chǎn)生上調(diào)影響。

NF-κB、Notch-1和SOCS-1的異常表達與結(jié)直腸癌有密切聯(lián)系，其表達參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、發(fā)生和發(fā)展的過程，因此NF-κB、Notch-1和SOCS-1的檢測可以對判斷結(jié)直腸癌的惡性程度、侵襲、轉(zhuǎn)移起到參考作用。通過本研究可以預(yù)測多靶點基因分析可能成為判斷結(jié)腸癌治療效果、預(yù)后的新領(lǐng)域。