陳冬志 趙會娟 尹曉琳 劉嘉琳 孟 明 侯明輝

(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，保定 071000)

非肥胖型糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠作為一種自發(fā)性人類1型糖尿病動物模型，其遺傳背景清楚，與人類T1D在免疫學(xué)特征、病理過程和臨床特征等多個方面具有相似之處，是研究T1D的主要動物模型[1，2]。通過對血糖、尿糖的監(jiān)測及胰島病理的觀察，我們初步證實(shí)雌性NOD小鼠T1D發(fā)病集中在22～26周齡，至30周齡，累積發(fā)病率可達(dá)70%。盡管T1D被認(rèn)為是主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病，但多種免疫細(xì)胞參與了T1D的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。本研究進(jìn)一步對NOD小鼠在未發(fā)病、發(fā)病初期、發(fā)病末期不同發(fā)病階段相關(guān)免疫器官中CD4+T和CD8+T 細(xì)胞、Th細(xì)胞及其亞群、iNKT細(xì)胞及其亞群、致炎性和抑炎性細(xì)胞因子以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)觀察，以期了解NOD小鼠不同發(fā)病階段細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 雌性NOD/Ltj 實(shí)驗(yàn)小鼠，日齡35～42 d(北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)于清潔的SPF 級動物室，室溫(23±2)℃，相對濕度(50±5)%，所有小鼠均自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)動物嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》進(jìn)行處理，動物處理程序經(jīng)過河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會認(rèn)證。

1.1.2主要試劑及儀器 PE-T-selected-CD1d tetramer購自MBL International,Woburn,MA公司；FITC-Anti-MouseTCR-β(553170)、Percp-CyTM5.5-Mouseanti-T-bet(561316)、Alexa Fluor647Mouse Anti-PLZF(563490)購自BD公司； Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer購自eBioscience；α-半乳糖神經(jīng)鞘胺醇(α-Galcer)購自ENZO Life Sciences；微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子檢測試劑盒(560485)、RPMI1640培養(yǎng)液購自Wisent公司；血糖儀購自三諾生物傳感股份有限公司；血糖試紙購自三諾生物傳感股份有限公司；尿糖試紙購自花都高爾寶生物技術(shù)有限公司；CD4-FITC、CD8-PE抗體、FACS Calibur細(xì)胞儀購自BD Pharmin-gen(CA，USA)；低溫低速離心機(jī)購自Beckman Coulter(CA，USA)。

1.2方法

1.2.1動物分組 雌性NOD/Ltj小鼠100只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。每周檢測2次尿糖，尿糖陽性的小鼠禁食不禁水8 h后斷尾取血，血糖儀檢測空腹血糖，連續(xù)2次血糖值≥11.1 mmol/L 即診斷為T1D發(fā)病模型鼠。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，隨機(jī)選取集中發(fā)病周齡段且符合要求的實(shí)驗(yàn)動物30只，每組10只。實(shí)驗(yàn)動物分3組，分別為未發(fā)病組(觀察期內(nèi)未發(fā)病)、發(fā)病初期組(鑒定發(fā)病1周內(nèi))、發(fā)病末期組(發(fā)病后4～5周)。所有實(shí)驗(yàn)動物觀察至30周齡。

1.2.2組織取材 無菌環(huán)境下取小鼠外周血、胰腺、胸腺、脾臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)。

1.2.3FACS檢測外周血、肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)中CD4+T、CD8+T細(xì)胞頻率 收集各組小鼠全血(每只120 μl)于流式管。過淋巴細(xì)胞分離液分離得到各組織淋巴細(xì)胞懸液，取1×106個細(xì)胞，100 μl PBS重懸。加入Percp-CD3、FITC-CD4、PE-CD8抗體各5 μl，4℃避光孵育20 min。外周血樣品加紅細(xì)胞裂解液1 ml,避光8 min,觀察澄清透亮后離心棄上清。所有樣品PBS洗滌2 次,重懸,加PBS定容500 μl,流式細(xì)胞儀Calibur上機(jī)檢測，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測脾臟、肝臟中Th亞群(Th1、Th2、Th17) 分離小鼠各組織，研磨制成單細(xì)胞懸液，淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，PBS 清洗后細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞密度調(diào)整為1×106～10×106個/ml接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基(含雙抗)，加入終濃度為50 ng/ml PMA，1 μg/ml IO，4 μl/6 ml GolgStop(含Monensin)刺激5 h。培養(yǎng)后離心重懸計數(shù)。每支樣品管中加入細(xì)胞106個。加預(yù)冷CytofixTMbuffer，充分重懸細(xì)胞，室溫避光孵育10 min細(xì)胞固定。stain buffer 清洗2次，加入1 ml 1×Perm/WashTMbuffer，避光孵育15 min細(xì)胞透化。每支樣品管加入50 μl 1×Perm/WashTMbuffer和20 μl cocktail，室溫避光孵育30 min。1×Perm/WashTMbuffer 清洗2次，500 μl stain buffer重懸細(xì)胞，流式檢測。

1.2.5FCM檢測外周血、脾臟、肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)中iNKT細(xì)胞頻率及iNKT1/iNKT2細(xì)胞亞群比率 收集各組小鼠全血(每只120 μl)于流式管。淋巴細(xì)胞分離液分離得各組織淋巴細(xì)胞懸液，取1×106個細(xì)胞，100 μl PBS重懸。加入FITC-TCR-β、PE-α-G-tet抗體各5 μl，4℃避光孵育30 min。外周血樣品加紅細(xì)胞裂解液1 ml，避光8 min,澄清透亮后離心棄上清。所有樣品PBS洗滌2 次，100 μl PBS重懸,每管加1 ml Foxp3 Fixation/Permeabiliz-ation working solution，避光4℃孵育30 min，加2 ml 1×Permeabilization Buffer，室溫500 g,5 min離心棄上清后重懸樣品，透化固定后加入Percp-CyTM5.5Mouseanti-T-bet、Alexa Fluor647Mouse Anti-PLZF各5 μl室溫避光孵育30 min，每管加入2 ml 1×Permeabilization Buffer，400 g,5 min室溫離心棄上清。PBS定容至500 μl，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6CBA檢測脾臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平 分離獲得各組織中淋巴細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)整為2×106個/ml置于12孔培養(yǎng)板中，無血清RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入PMA(50 ng/ml)、IO(1 μg/ml)進(jìn)行刺激，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，離心得培養(yǎng)上清。應(yīng)用 CBA 細(xì)胞因子試劑盒檢測各組織培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IL-10水平。梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。依不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為質(zhì)控指標(biāo)?；旌喜东@微球，每個實(shí)驗(yàn)管中加 50 μl 捕獲微球，標(biāo)準(zhǔn)品管中加50 μl梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣本管加入50 μl 樣本，加入50 μl PE 檢測試劑，室溫避光孵育2 h。每管加入1 ml洗液，離心棄上清，每管加 300 μl洗液重懸，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7Western blot檢測轉(zhuǎn)錄因子 PLZF、T-bet、GATA-3、ROR-γt表達(dá)量 取胸腺、脾臟、肝臟組織各0.1 g，勻漿處理。抽提試劑提取蛋白。蛋白預(yù)處理后依次進(jìn)行灌膠與上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。PVDF膜浸在5%脫脂牛奶中，于37℃搖床封閉2 h。按照抗體說明書建議比例，用一抗稀釋液將anti-GAPDH、anti-T-bet/Tb21、anti-GATA3、anti-PLZF、anti-ROR-γt抗體以1∶1 000稀釋，與PVDF膜4℃孵育過夜。TTBS液清洗。用抗體稀釋液將Goat anti-Rabbit IgG 以1∶1 000進(jìn)行稀釋，與PVDF膜室溫孵育1 h。TTBS液清洗。發(fā)光液與PVDF膜充分接觸2 min。熒光化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測各組胸腺PLZF表達(dá)情況,脾臟、肝臟中T-bet、GATA3、ROR-γt表達(dá)情況。采用 Image J 軟件記錄各個蛋白的 ID 值(灰度值)，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白的 ID 值/GAPDH ID 值。

2 結(jié)果

2.1CD4+T、CD8+T 細(xì)胞頻率變化 與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組CD4+T細(xì)胞頻率在脾臟、肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)中均顯著增加(P<0.05)；與發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組CD4+T細(xì)胞頻率在肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)及外周血中均顯著降低(P<0.05)；與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組CD8+T細(xì)胞頻率在脾臟、胸腺中顯著增加，在腹股溝淋巴結(jié)中顯著降低(P<0.05)，與發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組CD8+T細(xì)胞頻率在肝臟、胸腺中均顯著降低，在腹股溝淋巴結(jié)中顯著增加(P<0.05)。見圖1。

2.2Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群的變化 在脾臟，與未發(fā)病組和發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組Th1亞群顯著增加(P<0.05)，Th2、Th17細(xì)胞亞群三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在肝臟，與未發(fā)病組和發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組Th1亞群顯著增加(P<0.05)，與發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組Th2、Th17亞群比例顯著增加(P<0.05)，見圖2、3。

2.3iNKT細(xì)胞頻率變化 與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組肝臟、腹股溝淋巴結(jié)中iNKT細(xì)胞頻率均顯著增高(P<0.05)；與發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組外周血、肝臟中iNKT細(xì)胞頻率均顯著降低(P<0.05)；脾臟、胸腺iNKT細(xì)胞頻率三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.4iNKT細(xì)胞亞群變化 與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組和發(fā)病末期組胸腺iNKT1亞群比例均顯著增加，iNKT2亞群比例均顯著降低(P<0.05)；脾臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)iNKT1及iNKT2亞群比例三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與iNKT1亞群比較，iNKT2亞群在三組小鼠的脾臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)中均較低(P<0.05)， 在未發(fā)病組胸腺中，與iNKT1亞群比較，iNKT2亞群比例較高(P<0.05)，圖5，表1、2。

圖2 各組小鼠脾臟Th亞群細(xì)胞頻率(%)Fig.2 Mean frequency of Th subsets of each group in spleen(%)

圖1 不同組別不同組織中CD4+T、CD8+T細(xì)胞頻率Fig.1 Frequency of CD4+T and CD8+T cells in different tissues of different groups

2.5細(xì)胞因子水平 在脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中致炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-17A)、抑炎性細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)水平在發(fā)病初期較未發(fā)病組和發(fā)病末期組均顯著升高(P<0.05)；IFN-γ/IL-4比值表明， 發(fā)病初期較未發(fā)病組和發(fā)病末期組均顯著升高(P<0.05)。在肝臟中致炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-17A)水平隨小鼠病情進(jìn)展逐漸升高，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；抑炎性細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)水平在發(fā)病初期最高，發(fā)病末期顯著降低(P<0.05)。IFN-γ/IL-4比值表明，隨小鼠病情進(jìn)展比值逐漸增大，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)、圖6～8，表3～5。

圖3 各組小鼠肝臟Th亞群細(xì)胞頻率(%)Fig.3 Mean frequency of Th subsets of each group in liver(%)

2.6轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量 胸腺：轉(zhuǎn)錄因子PLZF相對表達(dá)量，三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。脾臟:與未發(fā)病組和發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組T-bet相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；GATA-3和ROR-γt相對表達(dá)量，三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肝臟：與未發(fā)病組和發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組 T-bet相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與未發(fā)病組和發(fā)病末期組比較，發(fā)病初期組GATA-3 和ROR-γt相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，圖7～9。

圖4 不同組別不同組織中iNKT細(xì)胞頻率Fig.4 Frequency of iNKT cells in different tissues of different groups

表2 各組小鼠iNKT2細(xì)胞比例(%)Tab.2 Ratio of iNKT2 cells in mice of each group(%)

圖6 各組織淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ/IL-4比值Fig.6 Ratio of IFN-γ/IL-4 in lymphocyte culture of each tissue

圖7 胸腺中PLZF相對表達(dá)量Fig.7 Expression of PLZF in thymus

圖8 脾臟中T-bet、GATA-3、ROR-γt相對表達(dá)量Fig.8 Expression of T-bet，GATA-3，ROR-γt in spleen.

表3 脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量(pg/ml)Tab.3 Cytokine content of lymphocyte culture in spleen(pg/ml)

表4 肝臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量(pg/ml)Tab.4 Cytokine content of lymphocyte culture in liver(pg/ml)

表5 腹股溝淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量(pg/ml)Tab.5 Cytokine content of lymphocyte culture in inguinal lymph node(pg/ml)

圖9 肝臟中T-bet、GATA-3、ROR-γt相對表達(dá)量Fig.9 Expression of T-bet,GATA-3,ROR-γt in liver

3 討論

以往的研究表明，針對胰島β細(xì)胞自身抗原的CD4+T和CD8+T細(xì)胞的活化是T1D發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[6]。我們首先檢測了相關(guān)免疫器官及外周血中CD4+T和CD8+T細(xì)胞頻率，發(fā)現(xiàn)與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組CD4+T細(xì)胞頻率在脾臟、肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)中均顯著增加(P<0.05)，發(fā)病末期與發(fā)病初期組比較，CD4+T細(xì)胞頻率在肝臟、胸腺、腹股溝淋巴結(jié)及外周血中均顯著降低(P<0.05)；與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組CD8+T細(xì)胞頻率在脾臟、胸腺中顯著增加(P<0.05)，發(fā)病末期與發(fā)病初期組比較，CD8+T細(xì)胞頻率在肝臟、胸腺中均顯著降低，說明發(fā)病初期CD4+T和CD8+T細(xì)胞的增加特別是CD4+T細(xì)胞的增加是導(dǎo)致胰島炎重要的免疫基礎(chǔ)。末期CD4+T和CD8+T細(xì)胞頻率的下降與T1D能量代謝障礙造成免疫器官功能下降有關(guān)。但與未發(fā)病組比較，發(fā)病初期組腹股溝淋巴結(jié)中CD8+T顯著降低(P<0.05)，而發(fā)病末期卻顯著增加(P<0.05)，這一結(jié)果值得進(jìn)一步研究。

Th亞群的失衡被認(rèn)為是T1D發(fā)生的重要免疫學(xué)機(jī)制[7,8]。進(jìn)一步檢測Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群結(jié)果顯示：在脾臟、肝臟中，與未發(fā)病組和發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組 Th1亞群比例顯著增加(P<0.05)。在脾臟中Th2、Th17細(xì)胞亞群三組兩兩比較均無顯著性差異(P>0.05)。在肝臟中，與發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組Th2、Th17亞群水平顯著升高(P<0.05)。在NOD小鼠發(fā)病末期表現(xiàn)出顯著的自身免疫異常和代謝紊亂，雖然Th2亞群比例在發(fā)病末期也有增加，但發(fā)揮促炎作用的Th1、Th17型細(xì)胞尤其是Th1型細(xì)胞仍然占據(jù)主導(dǎo)地位，這種促炎和抑炎的平衡狀態(tài)被打破是導(dǎo)致炎癥加劇的一個關(guān)鍵因素。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞在自身免疫性疾病中有重要作用，且與T1D的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9,10]。iNKT細(xì)胞是一群兼具NK功能和T細(xì)胞特點(diǎn)的新型免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，具有恒定的TCR 鏈(人Vα24-Jα18/Vβ11；鼠類Vα14-Jα18/Vβ8.2,7,2)，介導(dǎo)先天性免疫和獲得性免疫[11]。根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子iNKT細(xì)胞又可主要分為iNKT1、 iNKT2、 iNKT17三個亞型。iNKT細(xì)胞活化后可迅速分泌大量Th1、Th2型細(xì)胞因子，調(diào)控免疫細(xì)胞分化和免疫反應(yīng)類型[12,13]。已有報道T1D患者的iNKT 細(xì)胞數(shù)量低于健康人，NOD 小鼠中的iNKT 細(xì)胞也低于正常。當(dāng)iNKT 細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)時，T1D 發(fā)展受到抑制[14]。近年來Shamin 等[15]的研究認(rèn)為iNKT 對T1D 進(jìn)展有促進(jìn)作用，有關(guān)iNKT在T1D發(fā)病中的作用仍存在爭議[16,17]，iNKT細(xì)胞在T1D的發(fā)生發(fā)展過程中的作用仍未得到明確的闡述。

比較三組iNKT細(xì)胞頻率發(fā)現(xiàn)：發(fā)病初期組肝臟、腹股溝淋巴結(jié)中iNKT細(xì)胞頻率較未發(fā)病組顯著增高(P<0.05)，與發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組外周血、肝臟中iNKT細(xì)胞頻率顯著降低(P<0.05)，進(jìn)一步比較iNKT細(xì)胞亞群比例發(fā)現(xiàn)：發(fā)病初期和發(fā)病末期組胸腺iNKT1亞群比例較未發(fā)病組顯著增加(P<0.05)，而iNKT2亞群比例卻顯著降低(P<0.05)。在脾臟、肝臟、腹股溝淋巴結(jié)中三組iNKT亞群比例均無顯著性差異(P>0.05)。在發(fā)病早期iNKT細(xì)胞頻率的增加以及胸腺iNKT1/iNKT2亞群比例的翻轉(zhuǎn)，提示了iNKT細(xì)胞在NOD鼠發(fā)病早期可能加速了病情的進(jìn)展，而介導(dǎo)這一作用的主要是iNKT1細(xì)胞。當(dāng)然，還需要進(jìn)一步觀測iNKT其他亞群以明確參其是否參與了T1D發(fā)生發(fā)展。

對細(xì)胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)：在脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中無論是致炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-17A)還是抑炎性細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)在發(fā)病初期組較未發(fā)病組和發(fā)病末期組均顯著升高(P<0.05)； IFN-γ/IL-4比值表明，發(fā)病初期組較未發(fā)病組和發(fā)病末期組均顯著升高(P<0.05)。在肝臟中致炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-17A)水平隨小鼠疾病進(jìn)展逐漸升高(P<0.05)；抑炎性細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)水平在發(fā)病初期最高，發(fā)病末期顯著降低(P<0.05)；IFN-γ/IL-4比值表明，隨小鼠疾病進(jìn)展比值逐漸增大，在發(fā)病末期達(dá)高峰(P<0.05)，表明炎癥參與了NOD/Ltj小鼠自發(fā)T1D的病理生理過程。

PLZF是調(diào)控iNKT細(xì)胞分化發(fā)育的必需轉(zhuǎn)錄因子，在一定程度上反映了iNKT細(xì)胞的發(fā)育情況[18]。T-bet、GATA-3、ROR-γt分別是Th1、Th2、Th17型細(xì)胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子[19]。對上述轉(zhuǎn)錄因子的檢測發(fā)現(xiàn)：在胸腺中PLZF相對表達(dá)量三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，和不同病理狀態(tài)下胸腺中iNKT細(xì)胞頻率變化的趨勢一致。在脾臟和肝臟中與未發(fā)病組和發(fā)病初期組比較，發(fā)病末期組T-bet相對表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；在脾臟中GATA-3和ROR-γt相對表達(dá)量，三組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在肝臟中與未發(fā)病組和發(fā)病末期組比較，發(fā)病初期組GATA-3 和ROR-γt相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量和Th亞群變化趨勢相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了Th亞群的檢測結(jié)果。