王天楠 張 煌 陳益勝,2 徐學(xué)明,2 黃彩虹

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450045)

蘆丁(Rutin)又稱維生素P、蕓香甙等，廣泛存在于天然提取物中。蘆丁(圖1)的化學(xué)本質(zhì)是黃酮醇槲皮素與二糖蕓香二糖[α-L-鼠李吡喃糖基-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖]之間形成的糖苷化合物。其黃酮部分的酚羥基可以提供電子與活性氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)，在清除自由基方面具有較強(qiáng)的活性。因此蘆丁是一種強(qiáng)效的天然抗氧化劑，可以替代食品中人工合成抗氧化劑，且無毒副作用，因此在食品添加劑工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景[1]。此外，針對蘆丁疏水性差的特點(diǎn)，Viskupicova等[2]使用4～8個碳鏈長度的脂肪酸對蘆丁母體分子進(jìn)行?；鰪?qiáng)其油溶性，成功地將蘆丁的抗氧化活性應(yīng)用到油脂保藏領(lǐng)域。

除了抗氧化，大量研究表明，蘆丁還具有很多獨(dú)特的保健功效。例如，Cosco等[3]證明使用殼聚糖包埋的蘆丁表現(xiàn)出良好的抗炎能力；Ghorbani[4]系統(tǒng)地研究了蘆丁對血糖的控制能力和作用機(jī)理。此外，蘆丁有降低毛細(xì)血管通透性和脆性的作用，保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，可以用于防治高血壓腦溢血[5]。特別地，蘆丁所具有的潛在抗腫瘤功能也吸引了眾多的關(guān)注。Alonso-Castro等[6]研究證明蘆丁是決定天然萃取物抗癌作用最主要的功效因子之一。目前，蘆丁已經(jīng)成為很多保健食品的主要功效成分之一。

圖1 蘆丁的分子結(jié)構(gòu)Figure 1 The molecular structure of rutin

目前，保健品中蘆丁的測定主要采用基于分光光度計(jì)的比色法[7]。這是基于蘆丁分子在320～400 nm的紫外區(qū)具有較強(qiáng)的特征吸收。比色法操作簡單，對樣品清理幾乎沒有要求。但是考慮到天然產(chǎn)物含有豐富的黃酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)在這一波段的紫外吸收會對檢測結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾，因此比色法的可靠性難以保證。基于高效液相色譜的分析方法被譽(yù)為混合物分析的“金方法”，用其作為天然產(chǎn)物中蘆丁的分析方法具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[8-9]。但是必須注意的是高效液相色譜也表現(xiàn)出通量低和基質(zhì)耐受性差等固有的缺點(diǎn)。單次分析只能針對一個樣品，而且對樣品的清理要求較高，否則很容易出現(xiàn)色譜柱堵塞。難以滿足高效快速分析的原則。

平面色譜是最早發(fā)明的色譜技術(shù)之一，并且至今仍是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室不可或缺的分析手段。然而，傳統(tǒng)手工方式操作的平面色譜技術(shù)無論在分離能力還是檢測手段方面都已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于柱色譜技術(shù)。不過，高效薄層色譜(High performance thin layer chromatography，HPTLC)技術(shù)的出現(xiàn)和進(jìn)步改變了這些劣勢，并且代表了平面色譜技術(shù)發(fā)展的新方向。除了繼承傳統(tǒng)手動平面色譜技術(shù)的固有優(yōu)點(diǎn)(分析過程簡便且高通量，分析結(jié)果圖像化)，HPTLC在儀器化和自動化等方面有了長足的進(jìn)步，在分析能力和檢測精度方面已經(jīng)達(dá)到或者超過了傳統(tǒng)的液相色譜。除此之外，HPTLC作為一個開放的色譜系統(tǒng)，在生物傳感聯(lián)用檢測應(yīng)用領(lǐng)域有著無與倫比的優(yōu)勢。當(dāng)色譜過程結(jié)束后，HPTLC的分離結(jié)果以離散斑點(diǎn)的形式固定在色譜板上，而不是像柱色譜那樣流入廢液瓶中。經(jīng)過短暫的烘干，色譜板上殘留的有毒有機(jī)溶劑被揮發(fā)，使得分離結(jié)果可以通過噴灑或者浸漬的方式非常方便地與各種生物試劑、酶或者細(xì)胞生物傳感檢測相結(jié)合[10]。換而言之，在HPTLC分析中，色譜板不僅扮演了色譜固定相的角色，更重要的是為生物傳感的過程提供了一個理想的平臺。

Agatonovic-Kustrin等[11]的研究建立了一種HPTLC-DPPH聯(lián)用定量評估葡萄酒中主要多酚類物質(zhì)清除自由基的方法，同時創(chuàng)新建立了兩步梯度洗脫法，使得在無需對樣品進(jìn)行純化處理的情況下，在同一塊板上分析多種樣品成為可能；Perwez等[12]的研究利用了DPPH還原反應(yīng)和RP-HPTLC法，評估了沙特阿拉伯生長的4種金合歡樹種的乙醇提取物的抗氧化潛力，包括RP-HPTLC量化抗氧化生物標(biāo)志物蘆丁，通過光密度掃描得到的峰面積值評估金合歡樹種樣品的抗氧化能力。本研究擬吸取前人經(jīng)驗(yàn)，將1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)還原變色的反應(yīng)與高效薄層色譜分離相結(jié)合，以硅膠薄層板為載體，建立HPTLC-DPPH聯(lián)用測定保健品中蘆丁的方法，考察DPPH顯色反應(yīng)時間、流動相配比、光密度掃描參數(shù)對色譜分離、掃描效果的影響，建立薄層板上蘆丁與DPPH變色反應(yīng)的濃度—信號關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線以期實(shí)現(xiàn)保健品(槐米)中蘆丁的快速、高效、可靠定量分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蘆?。悍治黾?，美國Aladdin公司；

硅膠高效薄層板：分析型，規(guī)格10 cm× 20 cm，德國Merck公司；

3種保健品樣品(槐米提取物粉末)：市售；

電子天平：MB104E型，瑞士Mettler-Toledo公司；

半自動薄層點(diǎn)樣儀：Linomat 5型，瑞士CAMAG公司；

全自動薄層展開儀：ADC-2型，瑞士CAMAG公司；

光密度掃描儀：Scanner 3型，瑞士CAMAG公司；

薄層成像儀：DD70型，德國Biostep公司；

質(zhì)譜儀：Synapt Q-TOF MS型，美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精確稱取(10.0±0.1) mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mL甲醇中。制得1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于棕色容量瓶中，在4 ℃冰箱中恒溫避光保藏，保質(zhì)期1周。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL，與9.5 mL甲醇混合稀釋，使該標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為0.05 mg/mL。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作液測試當(dāng)天新鮮配置。

1.2.2 樣品制備 精確稱取保健品(槐米提取物粉末)樣品50.0 mg，分別與10 mL甲醇混合。將混合物在渦旋混勻器上震蕩1 min，然后置于超聲水浴30 min。于3 000 r/min 離心10 min，取2 mL上清液，用注射器過0.45 μm 纖維素濾膜去除其中的固體微粒。過濾后，用0.05 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作液作為參比，用雙波長紫外—可見光分光光度計(jì)測定濾液在360 nm波長的吸光度，以此為指導(dǎo)，用甲醇對濾液進(jìn)行逐步稀釋，使其吸光度在0.8～1.0。稀釋后的濾液直接用于薄層點(diǎn)樣分析，分別記為保健品1、保健品2、保健品3。

1.2.3 HPTLC色譜條件 為了獲得定量且可控的點(diǎn)樣結(jié)果，樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液都通過半自動薄層點(diǎn)樣儀在0.5 MPa 氮?dú)廨d氣的協(xié)助下以條帶狀吹掃到薄層板上。具體參數(shù)為：條帶寬度6 mm，距離薄層板底邊8 mm，進(jìn)樣速度100 μL/s，預(yù)排體積0.2 μL。第1個條帶中心距離薄層板左邊緣15 mm，所有條帶間距通過軟件自動計(jì)算得出。點(diǎn)樣結(jié)束后，將原點(diǎn)區(qū)域用50 ℃干燥1 min以除去溶劑殘留。點(diǎn)有樣品的薄層板在全自動薄層展開儀中進(jìn)行色譜分離。流動相配比乙酸乙酯/甲酸/乙酸/水(10/1.1/1.1/2，體積比)，展開距離為60 mm。色譜分離條件：相對濕度控制3 min(飽和氯化鎂溶液鼓泡調(diào)節(jié)相對水活度至35%左右)，薄層板預(yù)平衡10 min，整個展開過程耗時約30 min。待流動相前沿到達(dá)預(yù)定高度，展開過程自動停止。此后，將薄層板取出，放在薄層加熱器上60 ℃烘烤3 min，使得殘留在硅膠薄層上的流動相溶劑揮發(fā)。

1.2.4 原位衍生反應(yīng)和成像 將完成色譜分離后的薄層板通過自動浸漬裝置浸入DPPH衍生液中，移動速度1 mm/s，停留時間1 s。然后將蘸有DPPH衍生液的薄層板置于避光處反應(yīng)20 min。當(dāng)薄層板的紅棕色背景出現(xiàn)明顯的淺黃色抗氧化斑點(diǎn)后，用薄層成像儀對衍生結(jié)果進(jìn)行拍照成像，相機(jī)參數(shù)設(shè)定為：底部透射光源，自動對焦和校正。

1.2.5 光密度掃描定量 拍照成像后，薄層板上的衍生反應(yīng)結(jié)果通過光密度掃描定量分析。具體參數(shù)為：反射—熒光模式，D2&W燈，激發(fā)光波長530 nm，無濾光片，狹縫尺寸3.00 mm×0.30 mm (Micro)，掃描速度100 mm/s，數(shù)據(jù)分辨率100 μm/step。檢測到的色譜信號通過Wincat軟件進(jìn)行峰定義、基線校正和峰面積積分計(jì)算。

1.2.6 質(zhì)譜定性 參照DPPH顯色反應(yīng)的結(jié)果，在一塊沒有衍生的薄層板上確定目標(biāo)物的停留位置，用鉛筆做好記號。用剪刀在記號處剪下一個3 mm× 8 mm矩形薄層小片，剪切過程中要特別注意不要造成硅膠層的崩離。剪下的小片放置到盛有0.5 mL甲醇的離心管中震蕩萃取1 min。萃取液經(jīng)過0.45 μm尼龍濾膜過濾后使用Waters Synapt Q-TOF系統(tǒng)進(jìn)行分析(不接色譜柱，樣品直接進(jìn)入離子源)。質(zhì)譜檢測條件：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，陰離子檢測模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣體溫度400 ℃。錐孔和脫溶劑氣體的氣流速度分別為50，500 L/h。質(zhì)核比掃描范圍m/z50～800，碰撞能量6 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH反應(yīng)條件優(yōu)化

蘆丁與DPPH作用顯色是一個隨時間變化的過程。因此，為了確定薄層板上DPPH顯色反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間，對浸漬衍生后的薄層板上目標(biāo)物斑點(diǎn)的信號強(qiáng)度進(jìn)行了監(jiān)測(每張照片時間間隔為5 min)。如圖2所示，在浸漬后的前15 min內(nèi)，蘆丁形成的抗氧化斑點(diǎn)信號強(qiáng)度均快速上升并達(dá)到最高值，此后呈緩慢下降趨勢。因此可以確定薄層板上DPPH顯色反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間為15 min。

圖2 薄層板上蘆丁抗氧化斑點(diǎn)信號強(qiáng)度隨時間變化規(guī)律Figure 2 Intensity variation of rutin bands after immersion

2.2 色譜分離優(yōu)化

在HPTLC分析中，對硅膠板進(jìn)行目測檢視是最有效的、最直觀的評估方法。目測檢視可以明確顯示色譜分離效果以及目標(biāo)檢測物質(zhì)的大致濃度范圍。相較于目測檢視，儀器化的光密度掃描圖能夠獲得更加精確的色譜定量結(jié)果。由于保健品樣品成分復(fù)雜，除蘆丁外，還含有槲皮素等其他能與DPPH反應(yīng)變色的組分。為提高結(jié)果準(zhǔn)確度與重現(xiàn)性，同一種蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在同一硅膠板上進(jìn)行3次平行試驗(yàn)(同一種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次平行點(diǎn)樣)。3種保健品在同一硅膠板上分別進(jìn)行1次點(diǎn)樣。DPPH經(jīng)浸漬后均勻分布于整塊板上，含有蘆丁的區(qū)域(圖3中上方的3個變色區(qū)域)和含有槲皮素的區(qū)域(圖3中下方的6個變色區(qū)域)由深紫色變?yōu)闇\黃色，而其他區(qū)域保持淡紫色不變。在此基礎(chǔ)上，使用不同流動相進(jìn)行色譜條件優(yōu)化。本研究采用CAMAG ADC-2進(jìn)行色譜展開，全自動化的預(yù)飽和硅膠板平衡有效避免了“邊際效應(yīng)”問題。由圖3、4可知，在乙酸乙酯/甲酸/乙酸/水體積比為10/1.1/1.1/2時，蘆丁的比移值Rf為0.45，槲皮素的比移值Rf為0.65，同一軌道上的目標(biāo)物質(zhì)與干擾雜質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。因此，乙酸乙酯/甲酸/乙酸/水體積比為10/1.1/1.1/2是最佳流動相。同時，由圖5可知，目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)展開距離的顯著差異能使蘆丁在光密度掃描中具有良好的分辨率。

1～3. 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 ng/Zone(即軌道上每個斑點(diǎn)含有100 ng蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品) 4～6. 槐米樣品1～3

圖3 白光可視透射模式下的色譜結(jié)果圖

Figure 3 Chromatographic results visualized under white light in transmission mode

2.3 光密度掃描參數(shù)優(yōu)化

由圖4可知，硅膠板上蘆丁的最大吸收在530 nm。最初光密度掃描是采用吸收模式，掃描結(jié)果為反向吸收峰，數(shù)據(jù)無法分析，之后改用無濾光片的熒光模式重新掃描。在這一條件下，由于激發(fā)光被背景中沒有消耗反應(yīng)的DPPH分子吸收，形成低強(qiáng)度基線信號，而含有蘆丁的目標(biāo)物區(qū)域大部分DPPH被反應(yīng)還原，能夠反射大部分入射光，不使用濾光片就能避免反射光被截住而得不到檢測信號。除了掃描模式，光源也是影響光密度掃描結(jié)果的重要因素。一般情況下，熒光模式下會選用掃描結(jié)果具有高信噪比的汞燈作為光源。但是本研究中使用汞燈無法得到色譜峰信號，所以改用D2&W燈作為激發(fā)光源，以得到具有良好信噪比的色譜峰信號。狹縫尺寸、掃描速度和數(shù)據(jù)分辨率非關(guān)鍵參數(shù)，依照常規(guī)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)置。因此，最終確定的光密度掃描定量分析的具體參數(shù)為：反射—熒光模式，D2&W燈，激發(fā)光波長530 nm，無濾光片，狹縫尺寸3.00 mm× 0.30 mm (Micro)，掃描速度100 mm/s，數(shù)據(jù)分辨率100 μm/step。

波長分別為510，520，530，540，550 nm圖4 圖3中軌道5在不同波長下的光密度掃描圖

Figure 4 Corresponding densitogram of track 5 in figure 3 at 510, 520, 530, 540, 550 nm wavelength

1～3. 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100 ng/Zone(即軌道上每個斑點(diǎn)含有100 ng蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品) 4～6. 槐米樣品1～3 a. 蘆丁的信號 b. 槲皮素的信號

圖5 波長530 nm下圖3中軌道1～6的光密度掃描圖

Figure 5 Corresponding densitogram of track 1～6 in Figure 3 at 530 nm wavelength

2.4 定量方法驗(yàn)證

2.4.1 方法檢測限和線性 根據(jù)《食品檢驗(yàn)工作規(guī)范》要求，需要建立具有良好線性的檢測方法；而在實(shí)際應(yīng)用中，LOD/LOQ和其選擇性則至關(guān)重要?；诮?jīng)典五點(diǎn)法，在50～500 ng/Zone 的范圍內(nèi)對蘆丁進(jìn)行線性曲線的測定。如圖6所示，對衍生結(jié)果的光密度掃描檢測給出了良好的線性結(jié)果，R2=0.997 4。隨后通過公式LOD=3×SD/b和LOQ=10×SD/b計(jì)算得到方法檢測的檢測限和定量限，其中SD代表檢測信號的標(biāo)準(zhǔn)差(standard derivation)，b代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。計(jì)算結(jié)果為LOD=12 ng/Zone，LOQ=39 ng/Zone。

圖6 薄層板上蘆丁與DPPH變色反應(yīng)的濃度—信號關(guān)系曲線

Figure 6 Concentration-signal relationship curve of rutin and DPPH color change reaction on the silica gel plate

2.4.2 方法精密度和準(zhǔn)確性 通過測定目標(biāo)物蘆丁的添加回收率(分別進(jìn)行了3個添加水平試驗(yàn)，50，100，150 mg/g，每個添加水平重復(fù)3次)對本法的精確度和準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證。如表1所示，3種保健品樣品中的添加回收率為82%～97%，精密度RSD<10%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5 原位質(zhì)譜指紋圖譜鑒定

準(zhǔn)確定量及定性是檢測方法的基本要求。盡管光密度掃描能夠提供定量數(shù)據(jù)，但是目測檢視和光密度掃描都無法從分子水平區(qū)分目標(biāo)斑點(diǎn)間的差別。利用MS圖譜的這一特質(zhì)，可以從分子水平證明本方法利用HPTLC分離得到的目標(biāo)條帶確實(shí)含有蘆丁，而不是產(chǎn)生了假陽性，證明了本方法的可靠性。利用原位質(zhì)譜指紋圖譜對展開后硅膠板的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，記錄洗脫分子離子及其碎片荷質(zhì)比(m/z)特征，由于從硅膠板上洗脫的條帶夾雜了來自硅膠板的雜質(zhì)，因而圖上存在一些噪音，但是硅膠板上洗脫的最強(qiáng)信號為609.3，與蘆丁分子結(jié)構(gòu)相吻合。圖7進(jìn)一步比較了標(biāo)準(zhǔn)品和混合樣品的MS圖譜，可以看出不同軌道的MS圖譜之間的最強(qiáng)信號具有高度相似性，證明了此方法的準(zhǔn)確性。

表1 檢測方法的精度和準(zhǔn)確度驗(yàn)證Table 1 Validation of the method precision and accuracy (n=9)

圖7 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和硅膠板添加蘆丁的槐米提取物樣品條帶出洗脫的物質(zhì)的原位指紋圖譜

Figure 7 The mass signals of analytes measured by HPTLC-ESI/MS of pure standards of rutin and rutin spiked into glutinous rice extract sample

3 結(jié)論

本法的創(chuàng)新之處在于建立了薄層板上蘆丁與DPPH變色反應(yīng)的濃度—信號關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合硅膠板經(jīng)光密度掃描、計(jì)算后得到的峰面積值，達(dá)到可快速測定保健品中蘆丁的含量的目的。結(jié)果顯示，DPPH在硅膠板上對蘆丁的最優(yōu)顯色時間為15 min；通過使用乙酸乙酯/甲酸/乙酸/水(10/1.1/1.1/2，體積比)的混合物為流動相，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(35%濕度控制，10 min預(yù)平衡)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與干擾基質(zhì)的完全分離；隨后使用光密度掃描儀(反射—熒光模式，D2&W燈，530 nm激發(fā)波長，無濾光片)對色譜顯色結(jié)果進(jìn)行精確檢測，檢測限和定量限分別為12，39 ng/Zone可以在50～500 ng/Zone范圍內(nèi)獲得R2=0.997 4的方法線性，82%～97%的標(biāo)準(zhǔn)添加回收率和RSD<10%的精密度。此外，將色譜展開結(jié)果與電噴霧質(zhì)譜檢測聯(lián)用從分子水平證明本方法利用HPTLC分離得到的目標(biāo)條帶含有蘆丁而并非假陽性結(jié)果，證明本方法的可靠性。但本研究依然存在不足，DPPH乙醇溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用，其保存情況的好壞會影響顯影結(jié)果，并且DPPH顯影法的結(jié)果易受到不同因素的影響如溫度、光照、樣品pH等，而導(dǎo)致試驗(yàn)誤差，因此DPPH顯影法的具體反應(yīng)條件有待于進(jìn)一步確定；在用電噴霧質(zhì)譜檢測法證明方法可靠性時，從硅膠板上洗脫樣品時也會夾雜硅膠板的雜質(zhì)，對結(jié)果圖譜的分析帶來干擾，在未來試驗(yàn)中可以考慮嘗試濾膜過濾洗脫液等方法來去除雜質(zhì)。