肖瑞希 王馨悅 陳華國 周 欣

(1. 貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；2. 貴州師范大學(xué)貴州省藥物質(zhì)量控制及評價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；3. 貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制中心，貴州 貴陽 550001)

洋蔥(AlliumcepaL.)為百合科草本植物，又名玉蔥、球蔥等，富含花色苷，具有很強(qiáng)的抗氧化活性、抗菌、預(yù)防心血管疾病、降血糖、降膽固醇等作用[1-3]。花青素(又稱花色素)是廣泛存在于植物中的一類可溶于水的天然色素，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、降血糖、改善視力[4-6]等多種藥理作用，成為眾學(xué)者研究的熱點(diǎn)。目前，對洋蔥花青素提取物主要集中在提取、含量測定及活性的研究[7-8]，但是其花青素提取物及其含量及部分生物活性的相關(guān)性研究較缺乏，本試驗(yàn)通過高效液相色譜方法，檢測10個(gè)不同地區(qū)的洋蔥花青素提取物的指紋圖譜，確定共有峰，建立特征圖譜；并通過Pearson相關(guān)分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析共有峰與其抗氧化活性及AChE抑制活性的相關(guān)性，探究譜—效關(guān)系，可較系統(tǒng)、整體地評價(jià)洋蔥花青素提取物質(zhì)量。結(jié)果顯示不同地區(qū)洋蔥花青素提取物共有峰的峰面積與含量、抗氧化能力、AChE抑制活性都有較好的相關(guān)性，可為洋蔥花青素提取物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋蔥：分別購于廣東(惠州)、山東(濟(jì)南)、新疆(烏魯木齊)、重慶、浙江(杭州)、福建(福州)、四川(成都)、山西(太原)、湖北(武漢)、江西(南昌)、貴州(貴陽)；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，安捷倫科技有限公司；

Hypersil GOLD C18柱：250 mm × 4.6 mm，美國Thermo Scientific公司；

微量移液器：Eppendorf research plus型，德國Eppendorf 公司；

酶標(biāo)儀：Spectra Max Plus 384型，美國Molecular Device公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-80型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

明澈純水/超純水系統(tǒng)：Millipore Milli-QA10型，法國Millipore公司；

萬分之一天平：AL 204型，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；

微波爐：EM-202MS1型，合肥榮事達(dá)三洋電器有限公司；

無水乙醇：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

甲醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

矢車菊-3-O-葡萄糖苷：純度≥99%，貴州迪大有限公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

冰乙酸：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

甲酸：分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；

ABTS：純度≥98%，美國Sigma公司；

AChE：純度≥99%，大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花青素提取制備

(1) 花青素的提?。焊鶕?jù)參考文獻(xiàn)[9]修改如下，將洋蔥粉碎勻漿后，以1∶10 (g/mL)的料液比加入52%的乙醇溶液，微波提取4 min(功率469 W)，3 500 r/min 離心5 min，取上清液，減壓濃縮，冷凍干燥后得洋蔥花青素粗提物置于干燥罐中存放，備用。

(2) 花青素的純化：將洋蔥花青素粗提取物加水稀釋至濃度為0.75 mg/mL，HCl調(diào)節(jié)pH=1。將稀釋后的提取物以5 BV/h的速度上聚酰胺樹脂柱(60～100目)5 BV，3 BV純水洗脫，再用pH=3的80%乙醇以5 BV/h 的速度洗脫3.5 BV，洗脫液經(jīng)減壓濃縮后真空冷凍干燥得到洋蔥花青素提取物樣品，置于棕色瓶中保存。

1.2.2 供試品溶液制備 精確稱取純化后各樣品，加適量水復(fù)溶，配制成濃度為60 mg/mL的儲(chǔ)備液，存于-20 ℃ 中。準(zhǔn)確量取各樣品儲(chǔ)備液，加入適量純凈水，稀釋后冷卻至室溫，0.45 μm的水相微孔濾過，即得。

1.2.3 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品4.46 mg，加入適量純凈水溶解，冷卻至室溫，定容至5 mL，0.45 μm的水相微孔濾過，即得。

1.2.4 花青素含量測定 取1 mL各樣品溶液(以溶劑為空白)至10 mL比色管中，加入1%鹽酸甲醇溶液5 mL顯色，震蕩搖勻，50 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，于530 nm 處測定其吸光度值。以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為對照品，按上述條件，測定對照品530 nm處吸光值(Ac)。根據(jù)式(1)計(jì)算樣品中的花青素含量。

(1)

式中：

Ac——對照品的吸光度值；

As——樣品的吸光度值；

Cc——對照品物質(zhì)的量濃度，mg/mL；

Cs——樣品物質(zhì)的量濃度，mg/mL。

1.2.5 色譜條件 Hypersil GOLD C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：1%的甲酸水溶液(A)—乙腈(B)；0～10 min，92%～88% A；10～20 min，88%～86.5% A；20～25 min，86.5%～86.0% A；25～30 min，86.0%～83.5% A；30～60 min，83.5%～83.0% A；60～70 min，83%～60% A；70～80 min，60%～20% A；80～82 min，20%～92% A；進(jìn)樣量20.0 μL，柱溫35 ℃，檢測波長530 nm。

1.2.6 方法學(xué)考察

(1) 精密度考察：取適量貴州樣品，按1.2.2所述方法制備供試品溶液，按1.2.5的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，檢測得到液相色譜圖，計(jì)算主要色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD(%)值。

(2) 穩(wěn)定性考察：取適量貴州樣品，按1.2.2所述方法制備供試品溶液，按1.2.5的色譜條件分別在0，3，6，12，24 h進(jìn)樣，檢測得到液相色譜圖，計(jì)算主要色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD(%)值。

(3) 重復(fù)性考察：準(zhǔn)確稱取適量貴州樣品5份，按1.2.2 所述方法制備供試品溶液，按1.2.5的色譜條件，分別制成供試品溶液進(jìn)行分析，檢測得到液相色譜圖，計(jì)算主要色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD(%)值。

1.2.7 樣品指紋圖譜測定 按1.2.2所述方法制備供試品，采用1.2.5的色譜條件對不同地區(qū)的洋蔥花青素提取物進(jìn)行測定，記錄色譜圖。

1.2.8 清除DPPH自由基活性 根據(jù)文獻(xiàn)[10]修改如下：稱取9.86 mg DPPH溶于無水乙醇溶液中，定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。取40 μL不同批次的相同濃度樣品溶液加至酶標(biāo)板中，復(fù)孔3次，再加入DPPH溶液160 μL，于37 ℃ 避光反應(yīng)30 min，以乙醇作對照，空白溶液以相同體積純凈水代替，在波長517 nm處測定吸光度，計(jì)算樣品DPPH自由基清除率。

1.2.9 清除ABTS自由基活性 根據(jù)文獻(xiàn)[11]ABTS自由基溶液由14 mmol/L ABTS溶液和5 mmol/L K2S2O8水溶液以1∶1的體積比混合后避光反應(yīng)12～16 h，稀釋20倍。樣品溶液的制備，分別取50 μL不同地區(qū)的同濃度樣品溶液加至酶標(biāo)板，復(fù)孔3次，再加入200 μL ABTS自由基溶液混合均勻，室溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測定吸光度值(Ai)。分別以200 μL水和相同體積的水代替ABTS溶液和樣品溶液作為對照(Aj)及空白(Ao)，測吸光度。根據(jù)式(2) 計(jì)算樣品ABTS自由基清除率。

B=(Ao-Ai-Aj)÷Ao×100%，

(2)

式中：

B——ABTS自由基清除率，%；

Ao——空白吸光度值；

Aj——對照吸光度值；

Ai——734 nm處測定吸光度值。

(3)

式中：

C——AChE活性抑制率，%；

AUb——空白吸光度值；

AUo——空白組不加酶的吸光度值；

AUs——樣品吸光度值；

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016、OriginLab OriginPro 8.5、IBM SPSS Statistics 21、DPS V15.10和SIMCA 14.1對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測定

如圖1所示，除貴州洋蔥外其他10批次洋蔥花青素提取物含量較為接近，其范圍為0.3～1.2 mg/g，由于貴州地區(qū)的洋蔥挑選的顏色較深，花青素含量相對較高，可達(dá)5.00 mg/g，而湖北地區(qū)洋蔥花青素含量相對較低，不同地區(qū)樣品中花青素含量存在差異，其洋蔥花青素提取物含量大小依次為：貴州>山東>山西>廣東>四川≈浙江≈重慶>福建>湖北>新疆>江西。

圖1 不同地區(qū)洋蔥花青素的含量Figure 1 The content of anthocyanins extrat in onion from different areas

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度 共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD值分別為：0.14%～0.31%，1.12%～2.62%(均<3.0%)；符合指紋圖譜的要求，儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性 共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD值分別為：0.21%～0.31%，0.83%～3.28%；符合指紋圖譜的要求，該供試品溶液在24 h內(nèi)其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性 共有峰相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD值分別為：0.12%～0.18%，0.52%～1.78%；符合指紋圖譜的要求，該方法重現(xiàn)性較好。

2.3 樣品指紋圖譜測定

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)A(2004版)”以S4(貴州洋蔥)為參照圖譜，按照平均值生成對照圖譜并設(shè)置時(shí)間窗為0.3進(jìn)行自動(dòng)匹配后生成指紋圖譜，得到10個(gè)地區(qū)洋蔥花青素提取物的HPLC指紋圖譜，見圖2。

2.4 特征圖譜的構(gòu)建

根據(jù)不同地區(qū)洋蔥花青素提取物的指紋圖譜及相對保留時(shí)間的特點(diǎn)，選擇其共有峰且響應(yīng)值較高的峰作為特征指紋峰，最終有1、2、3、5、6、12號(hào)峰可作為洋蔥花青素提取物的特征峰，可初步認(rèn)定這6個(gè)峰代表物質(zhì)為洋蔥中共有的花青素，其中1號(hào)峰為矢車菊-3-O-葡萄糖苷，特征圖譜如圖3所示，峰面積見表1。

S1～S10分別代表福建、廣東、貴州、江西 、山東、山西、四川、新疆、浙江、重慶

圖2 不同地區(qū)洋蔥花青素提取物的HPLC指紋圖譜

Figure 2 HPLC fingerprint chromatogram of anthocy-aninsextrat in onion from 10 areas

2.5 相似度評價(jià)

不同地區(qū)洋蔥花青素提取物指紋圖譜與對照指紋譜圖的相似度為0.986～0.997，均>0.9，符合指紋圖譜的要求，結(jié)果見表2。

圖3 洋蔥花青素提取物的特征指紋圖譜Figure 3 The characteristic fingerprint chromatogram of anthocyanins extrat in onion

2.6 生物活性的研究

2.6.1 抗氧化活性 由圖4可知，11批洋蔥花青素提取物(濃度10 mg/mL)的ABTS自由基清除率皆在50%以上，ABTS、DPPH 2種評價(jià)方法的趨勢基本一致，其中廣東和山東地區(qū)洋蔥的差異較大，可能是不同地區(qū)洋蔥中不同的花青素物質(zhì)造成的，貴州、廣東、新疆、重慶地區(qū)洋蔥青素提取物的ABTS自由基清除率較高，分別為96.98%，85.03%，77.88%，70.88%，皆在70%以上。山東、山西、江西等7個(gè)地區(qū)的洋蔥的ABTS自由基清除率在50%～70%。

表1 不同地區(qū)洋蔥花青素提取物的HPLC指紋圖譜6共有峰峰面積?Table 1 Six common peaks of HPLC fingerprint chromatogram of anthocyanins extrat from onion in 10 areas

? S1～S10分別代表福建、廣東、貴州、江西、山東、山西、四川、新疆、浙江、重慶。

表2 洋蔥花青素提取物指紋圖譜相似度?Table 2 Similarity of fingerprints chromatogram of anthocyanins extrat in onion

? S1～S10分別代表福建、廣東、貴州、江西、山東、山西、四川、新疆、浙江、重慶；S為對照圖譜。

圖4 洋蔥花青素提取物抗氧化活性比較Figure 4 Comparison of antioxidant activities in anthocyanins extrat from onion

2.6.2 AChE制活性 如圖5所示，11批洋蔥花青素提取物(濃度10 mg/mL)的AChE抑制率大多在10%～20%，貴州地區(qū)的AChE抑制率最高為20%。湖北地區(qū)的最低為4.5%；其AChE活性抑制的大小順序?yàn)椋嘿F州>四川>江西>山西>廣東>福建>山東>浙江>新疆>重慶>湖北。

同時(shí)從洋蔥花青素含量及其生物活性研究可發(fā)現(xiàn)這11個(gè)地區(qū)中貴州地區(qū)洋蔥顏色較深，其花青素含量、抗氧化活性及AChE制活性最高，顏色較淺的湖北地區(qū)洋蔥花青素含量偏低，ABTS自由基清除率及AChE制活性也相對較低，說明樣品的顏色深淺程度可能會(huì)影響花青素含量及其部分活性，這與已有研究[13]報(bào)道的結(jié)果相一致。

2.7 譜—效關(guān)系分析

2.7.1 Pearson相關(guān)性分析(PCA) 通過PCA建立10個(gè)不同地區(qū)洋蔥花青素提取物特征圖譜的共有峰峰面積、含量、DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率、AChE抑制率5個(gè)變量之間的關(guān)系，結(jié)果用Pearson系數(shù)來表示，見表3。

由表3可知，ABTS和DPPH 2種評價(jià)抗氧化活性的結(jié)果在0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)為0.793，說明2種方法評價(jià)抗氧化能力結(jié)果一致；含量與6個(gè)色譜峰峰面積都有較好的相關(guān)性，且都在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，說明這6種物質(zhì)是洋蔥中的花青素主要物質(zhì)；6個(gè)色譜峰的峰面積以及總花青素含量都與抗氧化能力呈顯著正相關(guān)，與AChE抑制活性也有良好的相關(guān)性，說明這6種物質(zhì)可能對抗氧化能力及AChE的抑制活性起主要作用。

圖5 洋蔥花青素提取物抑制AChE活性比較Figure 5 Comparison of AChE inhibitory activitives in anthocyanins extrat from onion

表3 洋蔥相關(guān)性分析?Table 3 Correlation analysis of onion

? ** 表示在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；* 在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

2.7.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析(GRA) 采用GRA分析洋蔥花青素提取物特征圖譜中各共有峰與其抗氧化活性、抑制AChE活性作用的關(guān)聯(lián)度，探索洋蔥花青素提取物特征圖譜與其生物活性的聯(lián)系。

由表4可知，DPPH、ABTS、洋蔥花青素提取物含量、AChE抑制活性與其6個(gè)共有特征峰的峰面積的關(guān)聯(lián)順序分別為：X2>X3>X1>X5>X4>X6，X2>X3>X1>X4>X5>X6，X2>X5>X4>X1>X6>X3，X2>X3>X1>X5>X4>X6；4個(gè)因變量都與共有峰峰面積的關(guān)聯(lián)系數(shù)都>0.77，說明6個(gè)共有峰峰面積對洋蔥花青素提取物的生物活性有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，生物活性均具有協(xié)同作用，2號(hào)、3號(hào)峰代表的洋蔥花青素提取物對其活性起主要作用，其中2號(hào)峰代表的洋蔥花青素提取物與花青素含量的關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。

表4洋蔥花青素提取物共有峰峰面積與生物活性關(guān)聯(lián)度?

Table 4 The correlation between the area of onion common peak and biological activity

項(xiàng)目X1X2X3X4X5X6DPPH0.829 40.867 60.862 50.820 00.820 50.772 2ABTS0.828 90.868 30.849 70.819 00.817 20.770 0含量0.783 40.871 70.777 80.797 10.807 60.782 1AChE0.826 60.856 20.844 30.814 10.816 20.773 3

? X1～X6分別表示峰1、2、3、5、6、12。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC色譜方法，建立10個(gè)地區(qū)的洋蔥花青素提取物的指紋特征圖譜，其指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.986～0.997，均>0.9；確定了6個(gè)共有峰為特征吸收峰，可初步認(rèn)定洋蔥中含有6種共有的花青素提取物。體外活性試驗(yàn)檢測洋蔥花青素的抗氧化性及AChE抑制活性，每個(gè)地區(qū)的洋蔥花青素提取物均有一定的抗氧化活性及AChE抑制活性；同時(shí)通過PCA和GRA初步探索洋蔥花青素譜—效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)洋蔥花青素提取物共有峰的峰面積與含量、抗氧化能力、AChE抑制活性都有較好的相關(guān)性，可為洋蔥花青素的利用及研究提供新參考。 洋蔥中含有的6中共有花青素，其他5種花青素物質(zhì)及其洋蔥花青素在體內(nèi)的活性等還有待研究。