陳婕，曹奎榮，王曄青，孫祥良*

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016； 2.嘉興市農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)局，浙江 嘉興 314050)

葡萄(VitisviniferaL.)是嘉興市種植面積最大的果樹(shù)之一，在嘉興市農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[1]。隨著葡萄產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，葡萄栽培面積和苗木繁育數(shù)量急劇增加，與此同時(shí)，主要通過(guò)苗木和繁殖材料傳播的病毒病害也進(jìn)一步擴(kuò)展蔓延，危害日益嚴(yán)重。由于葡萄長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)性繁殖，容易感染和積累多種病毒，并隨著苗木和接穗的調(diào)運(yùn)不斷擴(kuò)散，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)不斷下降、嫁接成活率降低，樹(shù)體逐年衰退，給葡萄的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的影響。

目前，已報(bào)道的侵染葡萄的病毒約65種[2]，由這些病毒引起的病害中，分布最廣、危害最重的主要有葡萄卷葉病、葡萄扇葉病、葡萄斑點(diǎn)病和葡萄皺木復(fù)合病[3]。因此，本研究利用RT-PCR檢測(cè)結(jié)合PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法，對(duì)嘉興市葡萄主栽品種進(jìn)行病毒病原檢測(cè)，以期對(duì)嘉興地區(qū)主栽葡萄品種的病毒病種類(lèi)、帶毒率進(jìn)行系統(tǒng)的了解，并為以后無(wú)病毒苗木的繁育及推廣工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從嘉興市的南湖區(qū)、秀洲區(qū)、嘉善縣、海鹽縣和桐鄉(xiāng)市等5個(gè)縣區(qū)采集6個(gè)葡萄品種共162份樣品，包括藤稔47份，紅地球38份，醉金香34份，陽(yáng)光玫瑰33份，早生內(nèi)瑪斯6份和夏黑4份。春天采集嫩葉，采集方法是在新梢生長(zhǎng)期隨機(jī)選擇植株生長(zhǎng)點(diǎn)周?chē)哪廴~進(jìn)行采集。秋天在休眠期采集成熟枝條韌皮部，樣品采集后置于密封袋，并注明采集日期和地點(diǎn)。

1.2 試劑

用于檢測(cè)葡萄扇葉病毒(Grapevine fanleaf virus，GFLV)、葡萄卷葉相關(guān)病毒1(Grapevine leafroll-associated virus 1，GLRaV-1)、葡萄卷葉相關(guān)病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3)、葡萄病毒A(Grapevine virus A，GVA)、葡萄病毒B(Grapevine virus B，GVB)沙地葡萄莖痘病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV)和葡萄斑點(diǎn)病毒(Grapevine fleck virus，GFkV)等6種病毒[4]的特異性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器

樣品粉碎所用Tissuelyser-64組織研磨儀，購(gòu)自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；PCR擴(kuò)增所用TC-XP-D PCR儀，購(gòu)自杭州博日科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海培清科技有限公司。

1.4 檢測(cè)方法

RNA提?。簠⒄辗缎駯|等[5]的方法，在此基礎(chǔ)上用組織研磨儀研磨樣品，以便節(jié)約時(shí)間。

表1 用于葡萄主要病毒病原RT-PCR檢測(cè)的引物

RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄cDNA鏈的合成在500 μL無(wú)酶離心管中進(jìn)行，總體系為20 μL。第一步：離心管中依次加入DEPC水7.0 μL，6 bp隨機(jī)引物(TaKaRa公司)1.0 μL，總RNA 2 μL，混勻并瞬時(shí)離心后，95 ℃水浴7 min，冰上放置3 min。第二步：離心管中繼續(xù)依次加入5×M-MLV緩沖液 4.0 μL，DEPC水4.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 1.0 μL，200 U·μL-1M-MLV酶0.5 μL，50 U·L-1RNase Inhibitor 0.5 μL。將所有試劑混勻并瞬時(shí)離心后，置于37 ℃水浴1.5 h。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物用于PCR擴(kuò)增或置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為25 μL，分別加入無(wú)菌去離子水18.75 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物(表1)各0.5 μL，5 U·μL-1r-Taq0.25 μL，cDNA 2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，各引物相應(yīng)退火溫度條件下30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序：將擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行切膠回收，用北京艾德萊瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6個(gè)品種葡萄的帶病毒狀況

RT-PCR檢測(cè)結(jié)合PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明(表2)，162個(gè)葡萄樣品帶毒率高達(dá)91.4%(148/162)，其中單一病毒侵染率為30.9%(50/162)，兩種及兩種以上病毒復(fù)合侵染率為60.5%(98/162)：2種、3種、4種及5種病毒復(fù)合侵染率分別為34.6%(56/162)、14.8%(24/162)、7.4%(12/162)和3.7%(6/162)。除紅地球(帶毒率63.2%)以外，其他5個(gè)葡萄品種(藤稔、醉金香、陽(yáng)光玫瑰、早生內(nèi)瑪斯和夏黑)的帶毒率均為100%。

表2 162份葡萄樣品病毒檢測(cè)結(jié)果

2.2 7種病毒的檢出率以及在不同葡萄品種上的侵染率

對(duì)7種病毒的檢測(cè)結(jié)果分析表明(表2)，葡萄扇葉病毒GFLV在所有樣品中均未檢測(cè)到；引起葡萄卷葉病的GLRaV-1檢出率為1.2%(2/162)，僅在陽(yáng)光玫瑰樣品中檢測(cè)到陽(yáng)性，而同樣引起卷葉病的GLRaV-3的陽(yáng)性率為34.6%(52/162)，該病毒在除夏黑以外的5個(gè)品種中均檢測(cè)到陽(yáng)性樣品；引起皺木復(fù)合病的GRSPaV、GVA和GVB三種病毒的檢出率分別為29.6%(48/162)、36.4%(59/162)和11.1%(18/162)；引起葡萄斑點(diǎn)病的GFkV的檢出率最高，為84%(136/162)。但這些病毒在不同品種上的侵染率無(wú)明顯偏向性。6種病毒RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

3 討論

葡萄為多年生果樹(shù)，一旦被病毒侵染便終生帶毒，且無(wú)有效化學(xué)藥劑能控制[6]。葡萄病毒檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)葡萄無(wú)毒化栽培的重要保障，本研究利用RT-PCR分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)嘉興市不同縣區(qū)的主栽葡萄品種的帶病毒狀況進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)主栽品種的帶毒率均較高，且復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重。生產(chǎn)上，如果對(duì)病毒病不加以重視，將會(huì)對(duì)許多優(yōu)良品種的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重威脅，影響果農(nóng)經(jīng)濟(jì)收入。因此，在新品種引進(jìn)時(shí)，要做好病毒檢疫檢測(cè)，保證苗木的質(zhì)量，同時(shí)注意控制新老果園的距離，降低昆蟲(chóng)傳毒的概率。

圖1 6種病毒RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳