周秦，郭子卿，朱璞，徐誠，徐恒輝

(1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000； 2.金華雙依種子有限公司，浙江 金華 321000)

南瓜屬(Cucurbita)是一個大族群，種質(zhì)資源十分豐富，因其抗逆性強，適應(yīng)性好，地域分布廣，高產(chǎn)耐貯，果實形狀、大小、品質(zhì)各異，果色繽紛多彩，現(xiàn)已在世界各地廣泛栽培[1]。隨著人們對南瓜營養(yǎng)價值認識的增加，對南瓜屬資源利用的深入，以及在南瓜進行不同品種間雜交試驗過程中，研究者們逐漸意識到南瓜種質(zhì)資源研究的重要性，狹窄的遺傳基礎(chǔ)難以培育出突破性品種[2]。

SSR(simple sequence repeats，微衛(wèi)星序列即簡單重復(fù)序列)分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、操作簡單、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、成本低廉、呈共顯性等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于親緣關(guān)系分析，指紋圖譜構(gòu)建等[3]。盧亞楠等[4]利用RAPD、ISSR和SSR三種標(biāo)記方法對36份西葫蘆(美洲南瓜)的親緣關(guān)系進行了分析鑒定，三種標(biāo)記中SSR標(biāo)記的多態(tài)性最高。Gong等[5]采用SSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記對104份美洲南瓜種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系的鑒定，134對SSR引物和4個SCAR標(biāo)記共擴增出418個位點，分布于20個連鎖群。劉超[6]采用35對SSR引物對76份不同來源的籽用南瓜種質(zhì)資源進行SSR檢測，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記能夠準(zhǔn)確地將種質(zhì)依據(jù)來源進行分類。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)分析26份南瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性并進行類群劃分，估計其遺傳距離和性狀分類距離的相關(guān)性，以期為育種者開展種質(zhì)鑒定與創(chuàng)新、優(yōu)良品種選育和親本組配等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共26份(表1)，均為金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜所南瓜育種課題組經(jīng)過收集、試種篩選獲得，分別為筍瓜、中國南瓜、中國南瓜與筍瓜雜交材料，主要來源于日本和國內(nèi)其他地區(qū)引進的材料，少量為浙江省內(nèi)的農(nóng)家留種。

表1 參試南瓜的品系及來源

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

26份供試材料于3月5日播種于育苗聯(lián)棟大棚，3月31日取其第二片真葉約0.5 g，采用改良CTAB法進行DNA提取，利用紫外分光光度計和瓊脂糖檢測DNA質(zhì)量、濃度。將基因組DNA原液于-20 ℃保存，PCR擴增時取適量稀釋為25 ng·μL-1備用。

1.2.2 SSR引物合成與PCR擴增

選擇26對SSR引物[7](表2)，由金斯瑞生物科技有限公司合成，Taq酶購自金斯瑞生物科技有限公司。PCR實驗體系15 μL，其中dNTPs 2.4 μL(1.25 mol·L-1)，引物各0.2 μL(10 μmol·L-1)，酶0.2 μL(5 U·μL-1)，10×緩沖液1.4 μL(含Mg2+)，DNA約40 ng。反應(yīng)程序為95 ℃退火5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃(不同引物復(fù)性溫度不同)復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，4 ℃保存10 min。

表2 SSR引物序列與名稱

PCR產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測。方法：取下膠板，純凈水沖洗2次；放入0.2% AgNO3中染色15 min；取出純凈水沖洗2遍；放入顯影液中：15 g NaOH+7 mL甲醛+2 L水；取出水洗，照相。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)SSR標(biāo)記顯示的帶型，記錄易于辨認且擴增結(jié)果穩(wěn)定的多態(tài)性位點，根據(jù)各條帶的遷移率及其有無統(tǒng)計得到所有位點的二元數(shù)據(jù)，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。應(yīng)用非加權(quán)平均數(shù)法UPGMA進行聚類分析，通過NTSYS[8]遺傳分析軟件程序運算，利用Tree-Plot模型繪制生成樹狀圖。根據(jù)Smith等[9]的方法計算標(biāo)記位點的多態(tài)信息量PIC(polymorph ism index content)值，PIC值反映某一群體中遺傳多樣性豐富程度，PIC值與等位基因的數(shù)目有關(guān)，并與等位基因的頻率有關(guān)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性

從26對SSR引物中共篩選出22對擴增結(jié)果較好的引物，能明顯擴增出穩(wěn)定多態(tài)性條帶(圖1)。在26份南瓜材料中共檢測出98個等位基因變異，每對引物的等位基因變異數(shù)為1～12個，平均為4.5個；其中引物CMTp260擴增的等位變異最多達12個，引物CMTp145擴增的等位變異最少為1個。SSR標(biāo)記的多態(tài)信息量PIC為0.148(CMTp145)～0.840(CMTp260)，平均為0.460(表3)。

圖1 引物CMTp256對26份南瓜材料DNA的擴增結(jié)果

編號引物名稱等位變異數(shù)多態(tài)性信息含量編號引物名稱等位變異數(shù)多態(tài)性信息含量1CMTp19380.71312CMTp14240.4462CMTp9860.62813CMTp5830.4493CMTp13120.39714CMTp14510.1484Cmtp18760.66815CMTp6640.3965CMTp6340.30216CMTp260120.8406CMTp8890.78417CMTp6930.5017CMTp23540.26618CMTp17640.2588CMTp25640.45719CMTp8630.2039CMTp22470.75220CMTp16930.27810CMTp24830.35021CMTp23130.15611CMTp25730.55422CMTp20920.500

2.2 聚類

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)矩陣，用UPGMA法進行聚類分析，得到26份供試材料的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖2)，可分成2個類群。第Ⅰ類群較大，共有23份材料，均為筍瓜類型，分成6個亞群：第1個亞群僅1份材料(1號)；第2個亞群包括11份材料(3號、18號、14號、22號、9號、21號、7號、17號、11號、8號、10號)，其中3號和18號親緣關(guān)系很近，本試驗所用的22對引物無法將其區(qū)分開來，可能是姊妹系，8號和10號較好地聚在一起，且10號的系譜信息顯示其含有25%的8號的血緣；第3個亞群包括7份材料(4號、5號、16號、15號、20號、24號、25號)，其中4號、5號、16號較好地聚在一起，根據(jù)系譜信息顯示三者為同質(zhì)遺傳型組成品種的再組合；第4個亞群僅1份材料(12號)；第5個亞群包括2份材料(2號、19號)；第6個亞群僅1份材料(23號)。

第Ⅱ類群共有3份材料，與第Ⅰ類群的遺傳距離較遠，達0.4。分成2個亞群：第1個亞群包括2份材料(6號、26號)，均為中國南瓜類型；第2個亞群僅1份材料(13號)，為中國南瓜與筍瓜雜交所得，與其余品系的遺傳距離最遠，相比于筍瓜類型與中國南瓜類型更靠近。利用SSR分子標(biāo)記做出的聚類結(jié)果基本可以將供試材料按照不同品種群分開，這與前人按照植物化學(xué)分類法(主要是同工酶及等位酶)進行種內(nèi)分類的結(jié)果是相符的[11]。

3 小結(jié)與討論

本試驗結(jié)果表明，筍瓜與中國南瓜間的親緣關(guān)系相對較遠，這與其他采用不同標(biāo)記手段得出的分類結(jié)論一致[12-13]。在南瓜育種中，選擇遺傳差異豐富的親本進行雜交可以擴大遺傳基礎(chǔ)。利用SSR分子標(biāo)記可以從分子水平上區(qū)分不同品種間的遺傳距離，不受環(huán)境條件對植物形態(tài)的影響，十分穩(wěn)定可靠，是一種理想的遺傳多樣性分析技術(shù)。本研究利用26對南瓜SSR引物，對26份南瓜種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析，其中22對引物能明顯擴增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶，共檢測出98個等位基因變異，平均每對引物的等位基因變異數(shù)為4.5個，平均多態(tài)信息量為0.46。26份材料可以分為2個類群，與可追溯的系譜信息基本一致。

1～26為品種編號見表1圖2 26份南瓜種質(zhì)聚類結(jié)果

研究結(jié)果表明，收集到的南瓜種質(zhì)資源中，2份中國南瓜材料之間差異較大，23份筍瓜材料的種間遺傳組成上差異較小，遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種(系)間的遺傳多態(tài)性不豐富，推測可能多為同質(zhì)遺傳型組成品種的再組合。因此，還需要繼續(xù)收集更多的國內(nèi)外種質(zhì)材料，加大新材料的引進力度，加強親緣關(guān)系較遠地區(qū)間的基因交流及關(guān)鍵基因挖掘；在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)上結(jié)合遠緣雜交、胚挽救、輻射誘變等生物技術(shù)手段的應(yīng)用，積極開展種間雜交試驗，進而建立雜種優(yōu)勢利用模式，為南瓜種質(zhì)資源保存和新品種選育提供理論依據(jù)。