梁碧瑩，朱路文，唐強(qiáng)，葉濤，李宏玉，李保龍，阮野

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；3.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng)市550000

腦卒中是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞，導(dǎo)致血液不能流入大腦，而引起腦組織損傷的一種急性腦血管疾病。缺血性腦卒中占腦卒中的70%～80%，造成患者運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、言語(yǔ)、認(rèn)知等功能障礙[1-2]。腦缺血致腦細(xì)胞損傷，灌注恢復(fù)后，損傷反而進(jìn)一步加重，稱為缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷可能與血腦屏障功能紊亂有關(guān)?？p隙連接作為相鄰細(xì)胞間的直接通道，是進(jìn)行細(xì)胞間直接信息交流的基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細(xì)胞之間存在最廣泛的縫隙連接。連接蛋白43(connexin 43,Cx43)是縫隙連接主要組成部分，泛連接蛋白1(Pannexin 1,Panx1)是Pannexins家族的重要成員之一，兩者均參與腦缺血再灌注損傷，作用機(jī)制較為復(fù)雜[3]。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理是指在缺血前給予大量重復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，能夠誘導(dǎo)腦缺血耐受。前期研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理發(fā)揮腦保護(hù)作用，與降低炎癥反應(yīng)、抑制谷氨酸興奮性、減少細(xì)胞凋亡有關(guān)[4-5]。本文探討運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后血腦屏障通透性及Cx43和Panx1蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠54只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，許可證號(hào)SYXK(京)2010007，體質(zhì)量(220±10)g。安靜環(huán)境、溫度(21±2)℃、12 h明暗交替、清潔級(jí)飼養(yǎng)，環(huán)境適宜，通氣良好，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水。飼養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照科技部《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行。

隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組，每組18只。模型組自由活動(dòng)3周，制備大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，缺血2 h后恢復(fù)灌注；假手術(shù)組自由活動(dòng)3周，僅接受手術(shù)操作，線栓插入深度1 cm，不進(jìn)行再灌注；運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組跑臺(tái)訓(xùn)練3周，制備MCAO模型，缺血2 h后恢復(fù)灌注。

最后所有大鼠均安樂(lè)死處理。

1.2 器材和主要試劑

ZH-PT型動(dòng)物運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)：徐州利華電子。移液器：德國(guó)EPPENDORF公司。WD-9413B型凝膠成像分析系統(tǒng)：北京六一生物科技有限公司。DY89-ⅠⅠ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。Multiskan FC型酶標(biāo)儀：美國(guó)THERMO公司。小動(dòng)物麻醉機(jī)：深圳瑞沃德生命科技有限公司。激光多普勒血流儀：瑞典PERⅠMED公司。

伊文思藍(lán)：美國(guó)SⅠGMA公司。甲酰胺：溫州長(zhǎng)風(fēng)生物有限公司。Cx43、Panx1抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔二步法試劑盒：中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備

采用Koizumi[6]改良線栓法制備大鼠MCAO模型。使用小動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉大鼠，俯臥放置于手術(shù)臺(tái)上，顱頂正中切口，生物膠垂直固定光纖于前囟后2 mm右側(cè)旁開(kāi)5 mm。激光多普勒血流儀探測(cè)大鼠血流值。

大鼠仰臥、固定，頸部常規(guī)消毒、備皮，頸正中偏右切口。結(jié)扎頸總動(dòng)脈主干和頸外動(dòng)脈，石蠟包裹的魚(yú)線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，深18～22 cm。激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)血流阻閉，MCA血流降至基線值的30%以下視為造模成功。2 h后緩慢拔出線栓至頸總動(dòng)脈主干分叉處。血流達(dá)基礎(chǔ)血流的70%，視為再灌注成功。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)預(yù)處理

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組予跑臺(tái)訓(xùn)練，速度15 m/min，坡度0°，電擊刺激強(qiáng)度1.5 mA，每天訓(xùn)練30 min，每周6 d，共3周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 改良神經(jīng)功能評(píng)分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)

再灌注24 h后，采用mNSS評(píng)分[7]評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損程度。mNSS評(píng)分包括行動(dòng)能力測(cè)試、感覺(jué)測(cè)試、反射測(cè)試3大項(xiàng)，14小項(xiàng)，總分14分。評(píng)分越低，損傷程度越輕。

1.4.2 血腦屏障通透性

評(píng)分后，大鼠麻醉，股靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液4 ml/kg。2 h后，生理鹽水心臟灌流，至右心房流出澄清液體，取出每組6只大鼠腦組織10 ml/g浸入甲酰胺溶液中，勻漿，60℃恒溫水浴孵育24 h，4000 r/min離心20 min，取上清。酶標(biāo)儀測(cè)量光密度(optical density,OD)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出伊文思藍(lán)濃度。

1.4.3 Western blotting

每組6只大鼠腦組織-80℃冰箱凍存。蛋白質(zhì)抽提，制備蛋白上樣液。電泳、轉(zhuǎn)印、封閉，加Cx43一抗(1∶8000)、Panx1 一抗(1∶1000)、內(nèi)參 GAPDH一抗(1∶2000)孵育，加二抗孵育。取出PⅤDF膜浸入TTBS中，搖床搖動(dòng)5 min，重復(fù)4次；加ECL發(fā)光液，靜置5 min。暗室曝光。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的比率。

1.4.4 免疫組化染色

每組6只大鼠腦組織石蠟切片。脫蠟、入水、沖洗、高壓修復(fù)，置PBS中。滴加山羊血清封閉液，室溫 20～30 min。加 Cx43 一抗(1∶60)和 Panx1 一抗(1∶60)，4℃過(guò)夜?；謴?fù)至室溫后，PBS沖洗3次。滴加即用型二抗，37℃避光20 min，PBS沖洗3次。DBA顯色5～10 s，水洗終止；蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡觀察，Ⅰmage-Pro Plus軟件行圖像分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)面積與組織總面積的比率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用(xˉ±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS評(píng)分

假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。與模型組比較，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2 血腦屏障通透性

模型組伊文思藍(lán)含量高于假手術(shù)組(P＜0.05)。與模型組比較，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組伊文思藍(lán)含量下降(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠伊文思藍(lán)含量比較(μg/g)

2.3 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組Cx43和Panx1蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)。與模型組比較，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組Cx43和Panx1蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

表3 各組腦組織Cx43、Panx1蛋白表達(dá)

2.4 免疫組化染色

圖1 各組Cx43、Panx1蛋白表達(dá)

假手術(shù)組細(xì)胞輪廓清晰，有Cx43和Panx1陽(yáng)性表達(dá)。模型組細(xì)胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量Cx43和Panx1陽(yáng)性表達(dá)。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)。與假手術(shù)組比較，模型組Cx43和Panx1陽(yáng)性表達(dá)增加(P＜0.05)。與模型組比較，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組Cx43和Panx1陽(yáng)性表達(dá)降低(P＜0.05)。見(jiàn)表4、圖2、圖3。

3 討論

預(yù)處理的概念于1986年首次提出。Murry等[8]發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可減輕致死性缺血發(fā)生，認(rèn)為存在缺血耐受現(xiàn)象。1990年，Kitagawa等[9]證實(shí)腦缺血耐受的存在。預(yù)處理是指經(jīng)過(guò)多次重復(fù)干預(yù)，對(duì)隨后的致命傷害可以產(chǎn)生保護(hù)[10]。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可操作性強(qiáng)，安全性高，不易產(chǎn)生疼痛和損傷。既往研究表明[11-12]，連續(xù)3周運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可降低大鼠腦缺血后的炎癥反應(yīng)，減少腦梗死體積、腦水腫，降低神經(jīng)功能缺損，也可通過(guò)調(diào)節(jié)腦血流量保護(hù)大腦，降低缺血性損傷。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理具有腦保護(hù)作用[13]，作用機(jī)制具有多水平、多通道、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可以調(diào)節(jié)Toll樣受體4、核轉(zhuǎn)錄因子κB，抑制炎性反應(yīng)；也可以降低腦缺血再灌注大鼠血清白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子α含量。運(yùn)動(dòng)預(yù)處理還可通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)血管再生、抑制谷氨酸興奮性毒性、減小細(xì)胞凋亡等，發(fā)揮腦保護(hù)作用[16]。

表4 各組Cx43和Panx1陽(yáng)性面積比率比較

圖2 各組Cx43蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×400)

圖3 各組Panx1蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×400)

循環(huán)中的染料可以染色大多數(shù)組織和器官，但正常情況下大腦無(wú)法被染色，這是由于血液和大腦間存在血腦屏障[17]。伊文思藍(lán)可以迅速與白蛋白結(jié)合，當(dāng)血腦屏障被破壞時(shí)，伊文思藍(lán)可以隨白蛋白滲漏至腦組織中，因此常用伊文思藍(lán)法測(cè)量血腦屏障通透性。腦缺血后，血腦屏障通透性改變是腦水腫發(fā)生的重要原因[18]。血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變與缺血再灌注損傷關(guān)系密切，血腦屏障通透性增加會(huì)引起腦水腫和其他并發(fā)癥[19]。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是血腦屏障的構(gòu)成成分，可以維護(hù)血腦屏障的生理功能[20]。Cx43和Panx1是星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要組成，二者在腦卒中后有較為復(fù)雜的作用[21]。Cx43廣泛分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足，其表達(dá)增加會(huì)破壞血腦屏障通透性，導(dǎo)致一些大分子物質(zhì)可以透過(guò)血腦屏障，加重腦水腫[22]。也有研究認(rèn)為[23]，Cx43可起到保護(hù)作用，可能與釋放ATP有關(guān)。Panx1通道參與腦水腫過(guò)程，其抑制劑可以抑制大鼠腦缺血后水通道蛋白4表達(dá)，使大鼠腦組織水含量減少，腦水腫程度減輕[24]。使用Panx1阻斷劑也可明顯阻斷其神經(jīng)保護(hù)作用，認(rèn)為Panx1對(duì)腦缺血有一定保護(hù)作用[25]。Cx43和Panx1作用復(fù)雜，兩者在缺血性腦卒中疾病中發(fā)揮重要作用，需要深入研究。

本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注24 h后，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組mNSS評(píng)分降低，伊文思藍(lán)含量、Cx43和Panx1蛋白表達(dá)降低。表明運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可以減輕腦損傷，改善神經(jīng)功能，改善血腦屏障通透性，維持血腦屏障完整，下調(diào)Cx43和Panx1蛋白表達(dá)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。臨床可以制定合理的運(yùn)動(dòng)預(yù)處理方案，降低腦血管疾病發(fā)病率，減輕患者患病后的腦損傷。