郭晗晗， 鄢樹楓(綜述)， 陳 卓(審校)

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)自發(fā)現(xiàn)以來，因其在腫瘤轉移過程中扮演著重要的角色已成為當前腫瘤學的研究熱點。作為一種“液體活檢”，通過隨時獲取CTC進行檢測，可用于指導臨床制定治療方案、判斷患者預后、評價療效等，在腫瘤患者的實時個體化醫(yī)療中具有獨特優(yōu)勢。但是,由于CTC在血液中的數(shù)量稀少，對比每毫升血液存在的500億個紅細胞和上億個白細胞而言，CTC的數(shù)目只能以個位數(shù)計，這對其檢測造成了極大的挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展穩(wěn)定、靈敏及特異性高的檢測方法是開展CTC相關研究的關鍵。近年來，多種分離檢測CTC的設備取得了快速發(fā)展，為CTC的相關研究奠定了基礎。CTC的檢測主要基于其生物學特性(如標記蛋白的表達)或其物理特性(如大小、可變形性及電荷等)，筆者將針對目前CTC的分離檢測技術進行綜述。

1 基于CTC生物學特性的檢測方法

1.1基于CTC表面特異性蛋白質(zhì) 基于生物學特性檢測CTC的方法大多是通過識別CTC表面特異性表達的蛋白質(zhì)，最常用的方法之一是基于上皮特異性抗體表皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)進行檢測。如2004年強生子公司Veridex開發(fā)的Cell Search System是第一個也是唯一一個在美國、歐洲和中國均獲得臨床試驗批準的CTC檢測系統(tǒng)，基于CTC可同時表達EpCAM和細胞角蛋白(cytokeratins)8，18或19，但不表達白細胞標記蛋白CD45的特性[1]。Cell Search System利用結合了熒光染料的抗-EpCAM抗體磁性微粒，從血液樣本中分離出表達EpCAM的細胞，并利用結合了熒光染料的抗-CD45、抗-細胞角蛋白以及細胞核染料DAPI對CTC進行進一步篩選識別。Yoo等為進一步提高對CTC的檢測靈敏度，建立了SSDS方法，即將高密度的透明二氧化硅微珠表面與抗-EpCAM抗體結合，使CTC和微珠的復合體利用密度梯度離心與其他細胞有效分離[2]。該法對具有不同EpCAM表達水平的CTC具有良好的分離效果，尤其是對于低表達EpCAM的CTC細胞，比Cell Search System擁有更高的靈敏度。

大量研究表明，CTC具有高度異質(zhì)化現(xiàn)象。CTC在血液中可以不同形式存在，并具有上皮-間質(zhì)轉化功能(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，即喪失上皮細胞特征，獲得類似干細胞的表型[3]。因此，僅基于EpCAM進行CTC檢測，可能丟失一些潛在的更重要的CTC亞型[4-5]。因此，除了EpCAM之外，選擇其他CTC檢測標記物，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)[6]，以及針對攜帶EMT的CTC細胞的靶向標記物角蛋白、波形蛋白等是十分必要的，否則易出現(xiàn)假陽性結果，影響檢測準確度。

1.2基于CTC表面特異性標記物 近年來，除了利用天然抗體檢測CTC外，還出現(xiàn)了利用核酸適配子檢測CTC的方法[7-8]。與天然抗體相比，核酸適配子不僅與CTC表面具有更強的親和力和更高的特異性外，還有較高的穩(wěn)定性和良好的合成再現(xiàn)性，以及便于進行化學修飾等優(yōu)勢，尤其在不明確特定細胞標記物的情況下，可通過體外過程直接構建細胞特異性核酸適配子[9]。

Zeng等建立了一種利用核酸適配子報告子檢測CTC的方法，該報告子是由適配子和一對具有熒光猝滅作用的熒光分子組成。當適配子靶向細胞表面特異性標記物時，觸發(fā)細胞內(nèi)化作用，發(fā)生溶酶體降解，導致具有熒光猝滅作用的一對熒光分子分離，從而發(fā)出熒光信號，達到檢測目的[9]。這個過程(一步法)在數(shù)分鐘內(nèi)就可以完成，克服了抗體介導的檢測方法實驗步驟多、耗費時間長等缺點。但單個適配子只能檢測單一狀態(tài)的CTC，限制了其在臨床上的應用。Zhao等利用已有的適配子組的協(xié)同作用，建立了隨機設計適配子混合物的方法，即通過硅納米線基板嵌入式微流芯片，加強在非小細胞肺癌中對CTC的微分捕獲(兩步法)[10]。以上這些基于核酸適配子檢測CTC的新方法，在理論上與傳統(tǒng)的抗原-抗體免疫結合的檢測方法相比，具有一定優(yōu)勢，但尚未得到臨床上的驗證。

1.3基于CTC基因表達 逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR，RT-PCR)技術的應用，使對一些極為微量RNA樣品的分析成為可能?；贑TC與血細胞基因表達的差異，可利用RT-PCR對CTC進行檢測。該方法的關鍵在于找到合適的標記基因，從而將其表達水平與樣品的腫瘤細胞數(shù)進行關聯(lián)。一般來說，PCR產(chǎn)物有兩種定量方法，即相對定量和絕對定量。絕對定量方法需建立目標基因的標準曲線，與實時定量PCR的記錄進行對比；而相對定量方法僅需將參考基因(基本上是持家基因，如GAPDH，18S，RPLP0或B2M)與目標基因同時擴增即可?；静襟E如下：首先對樣本預處理，如密度梯度離心等以富集CTC細胞；然后選擇目的基因進行RT-PCR，如MGB1，CK-19，EGFR Ⅷ，hMAM等[11]；最后對檢測結果進行分析，確定CTC的數(shù)量。

目前，不少實驗室建立了多通道RT-PCR檢測CTC的方法[12-13]。該方法只需極少量核酸就可同時檢測多個目的基因。其中，Adna Test方法是利用免疫磁珠進行分離后，再通過多通道RT-PCR檢測CTC，其檢測限可達到2個CTC。借助該項技術，對轉移性乳腺癌患者樣本的檢出率為69%；Liquid Bead Array方法則是將多通道RT-PCR結合液珠陣列檢測CTC，可同時檢測6個基因，既節(jié)省了時間，也減少了所需的樣品量。以上這些利用RT-PCR檢測CTC，因所需樣品量少、靈敏性高等優(yōu)點已受到廣泛關注。但也由于所需樣品量極少，附帶出所得結果的統(tǒng)計學價值以及可重復性等方面的缺憾。

2 基于CTC物理特性的檢測方法

由于CTC的異質(zhì)化特性，使其具有不同表型。因此，僅僅基于細胞表面特異性標記物來進行檢測會丟失某些其他表型的CTC[5,14]，使檢測的靈敏度受限。而基于CTC的物理特性對其進行分離檢測，可較大程度地獲得更多不同亞型的CTC。

2.1基于CTC直徑大小 某些CTC的直徑大于血液中正常紅細胞和白細胞，因此，利用聚碳酸酯微孔過濾器，即利用孔徑為8 μm的過濾器過濾分離CTC，可讓較小的紅細胞和血細胞通過而有效截留CTC。之后出現(xiàn)了具有精確工程性能的CTC微型過濾器，但由于過濾器上的孔隙是隨機產(chǎn)生的，孔隙之間排列不整齊，孔隙大小也不夠均一，分離效果不是很理想。后來，通過優(yōu)化微型過濾器，使其擁有精確的孔徑和排列整齊的孔隙，明顯提高了對CTC的分離效果[15]。使用離子束蝕刻聚碳酸酯膜也可形成具有均一過濾孔的材料，達到優(yōu)化基于CTC尺寸的分離方法，如基于細胞大小的上皮腫瘤細胞分離設備(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)[16]。據(jù)報道，以聚對二甲苯膜為材料建立的一種3D微型過濾設備，可以捕獲血液中CTC。此外，微流系統(tǒng)“屋脊式”結構具有良好的分離與血細胞尺寸不同的CTC的效果[17]。如螺旋微流設備能在短時間內(nèi)處理大量樣本[18]，甚至在混合細胞的實驗中，也可達到至少85%的CTC檢測率。

2.2基于CTC可變形性 研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌和直腸癌CTC的尺寸與白細胞有重疊。與白細胞相比，這些CTC表現(xiàn)出更高的核質(zhì)比[19]。因此，可以基于細胞的可變形性來分離CTC和白細胞，進一步提高檢測的靈敏性。如微流分離平臺，這是基于細胞尺寸與變形性差異建立的平臺，可以對血液中CTC進行分離，獲得高純度CTC，還可進行后續(xù)的系列操作，如細胞培養(yǎng)、熒光原位雜交、組織病理學分析等[15]。Park等報道，借助震蕩流動使單個細胞通過錐形測微計時發(fā)生規(guī)模收縮而產(chǎn)生棘輪效應，可以讓CTC、白細胞及紅細胞產(chǎn)生不同的流動路徑，從而在尺寸基本相同的情況下達到無標簽分離血液中CTC的目的[20]。

2.3基于CTC表面粗糙黏附力 Chen等報道，由于腫瘤細胞和正常細胞對玻璃表面的黏附能力不同，可借助反應離子蝕刻(reactive ion etching，RIE)形成納米粗糙表面，成功捕獲不同類型腫瘤細胞[21]。

2.4基于CTC介電性質(zhì) 基于不同類型細胞間的電介質(zhì)差異，通過雙向介電電泳進行CTC分離，如DEP-FFF法可成功分離多種類型的腫瘤細胞。Moon等將多孔分流(multi-orifice flow fractionation,MOFF)與介電電泳結合用于乳腺癌CTC的分離，獲得了高分離效率[22]。Varadhachary等基于DEP-FFF分離方法，建立了商業(yè)化的微流平臺ApoStreamTM[23]。該方法的缺點在于：細胞質(zhì)和細胞膜的導電性在分離過程中會發(fā)生改變，因此需要弱化細胞間的相互作用來減小其影響。

3 集成設備檢測平臺

目前，對CTC的分離技術不僅要達到可靈敏地檢測CTC，而且要繼續(xù)對其藥物耐受性及轉移潛能進行分析。因此，結合多種CTC檢測分離方法，建立集成設備是目前針對CTC分離檢測的發(fā)展趨勢。Tang等將微流系統(tǒng)和免疫磁性分離系統(tǒng)結合，將CTC的捕獲效率提高到94%；同時，捕獲的CTC可在倒置熒光顯微鏡下進行原位觀察，有效減少了細胞損失，維持細胞活性高達93%[24]。此外，與免疫納米磁珠分離后的CTC還可繼續(xù)培養(yǎng)觀察。Zhao等利用硅納米基線板嵌入微流芯片，并結合適配子混合物對CTC進行分離[10]，這對表征CTC異質(zhì)化方面具有潛在的臨床應用價值。Adams等建立了多位一體的集成設備，可完成微型過濾器分離CTC、原位細胞培養(yǎng)、原位熒光雜交、組織病理學分析、H-E染色、光漂白以及復染等操作[15]。

4 結論與展望

筆者將近年來針對CTC的分離檢測方法進展進行了歸納總結(表1)。隨著CTC分離檢測手段的快速發(fā)展，越來越多的證據(jù)已表明，CTC作為液體活檢技術，在癌癥的早期檢測、轉移復發(fā)風險評估(預后信息)、治療靶標和耐藥機制的確定、實時治療的監(jiān)測、患者的分層等多方面均有重要應用價值。但是，目前CTC作為腫瘤標記物進入臨床檢測還有一定困難。CTC分離檢測技術進入臨床應用，亟待解決的問題之一是要建立統(tǒng)一、規(guī)范化的評價標準。此外，由于CTC在蛋白質(zhì)、RNA、基因組水平都攜帶了大量腫瘤部位的信息，CTC檢測手段已不僅僅局限于檢測，而是越來越側重于捕獲活的CTC細胞，通過其在細胞水平和分子水平上的表征，獲得包括相關腫瘤轉移與復發(fā)、藥物耐受性等信息。未來，這一領域仍將是研究熱點。

表1 循環(huán)腫瘤細胞分離檢測方法