常佳迎，劉樹森，馬紅霞，石潔，郭寧，張海劍

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黃淮海地區(qū)夏玉米彎孢葉斑病菌遺傳多樣性分析

常佳迎，劉樹森，馬紅霞，石潔，郭寧，張海劍

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心， 河北保定 071000）

【目的】針對黃淮海地區(qū)發(fā)生的玉米彎孢葉斑病，通過分子生物學(xué)技術(shù)，明確其致病菌新月彎孢（）在不同地區(qū)和年份間的遺傳差異及親緣關(guān)系，為研究該病害的發(fā)生和流行提供數(shù)據(jù)資料。【方法】對2013、2016和2017年采集自黃淮海地區(qū)5?。ê幽稀⒑颖?、山東、安徽、江蘇）的病樣進(jìn)行分離，并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（ITS和EF-1序列分析）對分離到的菌株進(jìn)行鑒定，共獲得175個新月彎孢菌株。從哥倫比亞大學(xué)開發(fā)的通用引物中篩選出13條多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物，利用篩選出的引物對175個新月彎孢菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，利用Popgen32軟件計算多態(tài)性比率、Shannon’s信息指數(shù)、群體間的遺傳距離和遺傳相似性，使用NTsys2.10e軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析和基于遺傳相似系數(shù)的主坐標(biāo)分析，構(gòu)建聚類分析圖和散點(diǎn)圖?！窘Y(jié)果】利用篩選出的引物對175個菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得105條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為100%。在群體平均水平上，基因多樣性水平（H）為0.3867，Shannon’s的信息指數(shù)（I）為0.5682，表明玉米彎孢葉斑病菌具有豐富的遺傳多樣性；不同地理種群間的遺傳多樣性存在一定差異，河南和安徽種群遺傳多樣性最高，江蘇種群較低；年度間相同地理來源的菌群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相同年份不同地理來源菌群親緣關(guān)系較近。聚類分析顯示所有菌株相似系數(shù)為0.51—0.93，在相似系數(shù)為0.59水平上，175個菌株被劃分為2群5個亞群，亞群間表現(xiàn)出年度間的差異，不同地理種群病菌間存在基因交流，遺傳相關(guān)性較高；主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，同一年份的菌株明顯聚集在一起?！窘Y(jié)論】引起黃淮海地區(qū)玉米彎孢葉斑病的病原菌群體存在較高的遺傳變異，地域相鄰的病菌遺傳關(guān)系較近；同一地區(qū)的菌株在年度間表現(xiàn)出一定遺傳距離，而同一年份不同地理來源的菌株遺傳距離較近。引起該地區(qū)玉米彎孢葉斑病的新月彎孢菌株不是以本地菌源為主，其主要菌源可能來自南方水稻和草坪草或東南亞玉米生產(chǎn)區(qū)，但也存在少量存活于地表病殘體上的菌株可作翌年的初侵染源。

新月彎孢；黃淮海地區(qū)；遺傳多樣性；ISSR

0 引言

【研究意義】玉米彎孢葉斑?。–urvularialeaf spot of maize）是主要由新月彎孢（）引起的葉部病害，20世紀(jì)80年代以來，在遼寧、吉林、北京、天津、河北、山東、河南、安徽、江蘇、云南等玉米種植區(qū)相繼發(fā)生，已成為繼大斑病、小斑病之后的又一重要葉部病害，對玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[1-4]。2013年在安徽北部和河南東南部發(fā)生較嚴(yán)重，病級為3—7級，嚴(yán)重地塊可達(dá)9級；2017年在河北省和山東中部發(fā)生普遍，但發(fā)病程度較輕，為1—3級；在安徽北部發(fā)生較重，病級普遍為3—7級，其他年份和地區(qū)僅見零星病斑。該病害的發(fā)生具有間歇性，其在我國的發(fā)生和流行規(guī)律目前尚不十分明確。研究玉米彎孢葉斑病不同年份和不同發(fā)生區(qū)域病原菌群體的遺傳多樣性，有助于了解各地病原菌的遺傳結(jié)構(gòu)，明確年度間不同地理種群間的遺傳關(guān)系，可為研究病害的發(fā)生規(guī)律和流行趨勢提供重要的基礎(chǔ)信息，并為病害的田間防控和預(yù)測預(yù)報提供重要依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】物種DNA的多態(tài)性可通過多種分子標(biāo)記技術(shù)快速、高效地檢測出來，如RAPD、RFLP、AFLP、ISSR、SSR等[5-7]。其中ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可靈敏高效地檢測基因組DNA的多態(tài)性，與RAPD分子標(biāo)記技術(shù)相比，其具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，成本低、操作簡單，適合大樣本的檢測，現(xiàn)已在許多物種的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)、物種來源、物種形成和種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[8-12]。在彎孢葉斑病菌遺傳多樣性方面，范永山等[13]研究表明，河北省新月彎孢種內(nèi)存在較大的遺傳差異；張欣芳等[14]對東北地區(qū)的彎孢菌遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)病菌的遺傳多樣性與致病性有一定關(guān)系，與地理來源無密切關(guān)系；龔國淑等[15]對10個省（市）的新月彎孢菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確了新月彎孢種內(nèi)菌株的遺傳多樣性與致病性相關(guān)，且與地理來源無直接關(guān)系，推測可能與各地頻繁調(diào)運(yùn)種子所導(dǎo)致的病菌在各地擴(kuò)散有關(guān)；王曉東等[16]使用12個ISSR引物和4個UP-PCR引物對采集自遼寧和安徽的玉米彎孢葉斑病菌進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)ISSR技術(shù)更適合對彎孢病菌的遺傳多樣性進(jìn)行分析，同時證明彎孢病菌存在豐富的遺傳變異，且與地理來源無關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有研究表明，新月彎孢的遺傳多樣性與地理來源無關(guān)，而這種現(xiàn)象是由何種因素所導(dǎo)致未見研究報道，且年度間不同地理來源的病菌遺傳多樣性和親緣關(guān)系尚未明確。因此，本研究以黃淮海地區(qū)3年的彎孢病菌為研究對象，采用穩(wěn)定性和多態(tài)性較好的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對彎孢病菌年度間不同地理種群進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用遺傳多樣性信息對病害發(fā)生的特征進(jìn)行解析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對采集于2013、2016和2017年黃淮海地區(qū)的玉米彎孢葉斑病菌，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對不同省份和不同年份間的病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，揭示黃淮海地區(qū)玉米彎孢葉斑病的流行規(guī)律，為病害防控及相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2013、2016和2017年9月中下旬，采集黃淮海地區(qū)（河南、河北、山東、安徽、江蘇）夏玉米彎孢葉斑病病葉，記錄采樣地點(diǎn)、時間等基本信息，放于標(biāo)本夾中吸除水分后，干燥條件下保存于信封袋中，采用常規(guī)病害組織分離法對樣品進(jìn)行病原菌分離及單孢純化[17-18]，分離獲得的所有菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定（ITS和EF-1序列分析），得到175株新月彎孢病菌（表1）。室內(nèi)試驗(yàn)于2018年3月在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.2 模板DNA的制備

將分離到的175個菌株分別接種到PDA平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d，用打孔器（直徑為1 cm）取3個菌餅放入PD培養(yǎng)基中，在28℃，180 r/min條件下培養(yǎng)5 d，過濾收集菌絲。收集的菌絲經(jīng)冷凍干燥后，采用真菌基因組提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA。采用ND2000紫外分光光度（Thermo，USA）測定DNA的濃度，統(tǒng)一稀釋至50 ng·μL-1，貯存于-20℃保存，備用。

1.3 ISSR分析

1.3.1 ISSR引物篩選 隨機(jī)選取2013和2016年各1個菌株和2017年的2個菌株的DNA作為模板，對加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia，UBC）60條引物進(jìn)行篩選，選取擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的13條引物用于本試驗(yàn)175個DNA樣品的擴(kuò)增。

1.3.2 ISSR-PCR體系及程序 PCR反應(yīng)體系：2×Es TaqMasterMix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）1.5 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。采用的13條引物見表2。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火（視不同引物而定）45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上以電壓100 V，電流100 mA，進(jìn)行電泳50 min，隨后使用GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 對ISSR電泳譜帶進(jìn)行統(tǒng)計，分別用1和0表示條帶的有無，缺失條帶記為“9”或“.”。使用Popgen32生物軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)運(yùn)算，計算群體內(nèi)和群體間的Shannon’s指數(shù)和Nei’s指數(shù)、等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、群體間的遺傳距離和遺傳相似性[19-21]；利用NTsys2.10e軟件，采用clustering模塊中的SAHN進(jìn)行UPGMA聚類分析，構(gòu)建供試菌株的系統(tǒng)聚類圖，并進(jìn)行基于遺傳相似系數(shù)的主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCA）。

2 結(jié)果

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增

從60個引物中篩選出13條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的引物（表2），對175個采集自不同年度和不同地區(qū)的菌株進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增（圖1）。這些引物都具有較好的擴(kuò)增多態(tài)性，共獲得105個條帶，多分布在200—2 000 bp，其中多態(tài)性條帶105個，占100%。不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)目不同，多為6—11條，平均每個引物產(chǎn)生8個多態(tài)性條帶。其中841號引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多（11條），而引物823和847擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少（6條），13條引物的多態(tài)性條帶比例均為100%（表2）。

2.2 新月彎孢遺傳多態(tài)性分析

將分離到的175株新月彎孢按省份分為不同地理來源的5個種群，其遺傳多樣性分析如表3所示。在群體平均水平上，多態(tài)位點(diǎn)為105個，多態(tài)性位點(diǎn)平均百分率為100%，觀察等位基因數(shù)（Na）為2.0000，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.6761，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.3867，Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.5682，表明新月彎孢群體存在豐富的遺傳變異。

不同地理來源的種群間，H值在0.2170—0.3665，I值在0.3171—0.5438，表明新月彎孢的遺傳多樣性在不同地理種群間存在一定差異?？傮w而言，河南（0.3662）和安徽（0.3665）種群遺傳多樣性最高，山東（0.3109）和河北（0.3415）種群次之，江蘇（0.2170）種群較低。

2.3 新月彎孢遺傳相似性分析

為進(jìn)一步分析新月彎孢各地理種群間的遺傳分化程度，將分離到的175株新月彎孢菌株按不同年度和省份分組，計算了Nei’s遺傳相似性GS和遺傳距離GD（表4），以及群體間的基因分化系數(shù)Gst值。不同年份各地理種群間的遺傳相似系數(shù)為0.6316—0.9869，遺傳距離為0.0132—0.4594，表明不同年份地理種群間的分化程度不同，遺傳距離不一致。2013年河南與安徽的菌株群體遺傳相似系數(shù)最高（GS=0.9869），遺傳距離最近（GD=0.0132），2017年江蘇與安徽的菌株群體，山東與河南、河北的菌株群體遺傳相似系數(shù)較高，表明同一年份不同地理種群間相關(guān)性較高；江蘇2017年菌株群體與安徽2016年菌株群體遺傳相似系數(shù)最小（GS=0.6316），遺傳距離最遠(yuǎn)（GD=0.4594），2016年安徽與2013年安徽、河南菌株群體遺傳相似系數(shù)較小，表明相關(guān)性較低。

表1 供試菌株

表2 ISSR引物擴(kuò)增

圖1 4個引物對部分新月彎孢菌株基因組DNA的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

表3 新月彎孢不同地理種群的遺傳多樣性水平

表4 新月彎孢不同地理種群間的遺傳相似性和遺傳距離

對角線上方為遺傳相似系數(shù)，下方為遺傳距離Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

2013和2016年各省份之間的遺傳相似系數(shù)分別為0.9869和0.7510，遺傳距離分別為0.0132和0.2863；2017年各省份之間的遺傳相似系數(shù)為0.8698—0.9491，遺傳距離為0.0522—0.1395；表明相同年份不同地理來源的菌株具有較小的遺傳差異。

安徽省2013與2016、2017年的菌群遺傳相似系數(shù)分別為0.6550和0.7644，2016與2017年為0.6771；河南省2013與2016、2017年的菌群遺傳相似系數(shù)分別為0.8559和0.8623，2016與2017年為0.7847，表明年度間菌群的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2013、2016和2017年菌株群體間的Gst值為0.1569，表明不同年度間遺傳變異占種群總遺傳變異的15.69%，大部分遺傳變異（84.31%）發(fā)生在種群內(nèi)。菌株群體間的基因流Nm為2.6869（＜4），表明不同年度間種群有一定的遺傳差異；5個地理種群總基因多樣性Ht為0.3857，各個種群內(nèi)基因多樣性Hs為0.2582，群體間的基因多樣性Dst為0.1275，表明相同年份和省份來源的菌株具有較近的親緣關(guān)系，各地區(qū)新月彎孢的基因流Nm為2.9420，表明不同地區(qū)間存在一定的基因交流。

2.4 新月彎孢ISSR聚類分析及主坐標(biāo)分析

利用NTsys2.10e軟件對175個菌株進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，菌株間具有豐富的遺傳多樣性，相似系數(shù)在0.51—0.93。在相似系數(shù)0.59水平上，所有的菌株被分為2個大類群（Group 1和Group 2）5個亞群（subgroup）。Group 1包含173個菌株；Group 2包括河南（2013和2017年各1株）2個菌株。Group 1又分為5個亞群，subgroupⅠ為2013年采集自河南和安徽省的63個菌株和2016年采集自河南開封市的1個菌株；subgroupⅡ?yàn)?016年采集自河南和安徽的18個菌株；subgroupⅢ為2013年采集自河南許昌市的1個菌株；subgroupⅣ為2017年采集自河南、河北、山東、江蘇和安徽的89個菌株；subgroupⅤ為2013年采集自河南周口市的1個菌株。地理種群之間新月彎孢表現(xiàn)出地域相鄰，其遺傳關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)較高的特點(diǎn)，如河南與安徽，河北與山東，表明不同地域的菌株來源可能相近；同一地區(qū)的菌株在年度間表現(xiàn)出一定遺傳距離，遺傳相似系數(shù)較低，表明年度間的菌株初侵染來源可能存在不同。

利用NTSY2.10軟件對175份新月彎孢菌株進(jìn)行基于遺傳距離的主坐標(biāo)分析（PCA），前3個主坐標(biāo)顯示遺傳變異分別為11.81%、6.79%、5.79%。三維散點(diǎn)圖（圖3）顯示，175個菌株形成了3個較為獨(dú)立的分布區(qū)，2013、2016、2017 3個年份分別聚合為一個獨(dú)立的分布區(qū)，這與聚類分析結(jié)果基本一致。

1—175：新月彎孢菌株編號number of C. lunata strains；坐標(biāo)軸1、2、3分別代表前3個主成分對遺傳變異的貢獻(xiàn)率Coordinate axis 1, 2, 3 represent the contribution rate of the first three principal components to genetic variation, respectively

3 討論

3.1 新月彎孢的遺傳多樣性

基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物、病原菌等物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究，馬紅霞等[22]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)證明禾谷鐮孢（）復(fù)合種菌株群體內(nèi)存在豐富的遺傳變異，且遺傳多樣性與地理來源有關(guān)；郭云燕、鄢洪海等[23-24]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了玉米南方銹病病原菌（）的遺傳多樣性，并對其初侵染源進(jìn)行了探討。本研究通過對2013、2016和2017年分離自黃淮海地區(qū)5省的175個新月彎孢的ISSR片段多樣性進(jìn)行分析，得到105個多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為100%，表明新月彎孢具有豐富的遺傳變異，這一結(jié)果與王曉東等[16]的研究結(jié)果一致。

在群體平均水平上，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.3867，Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.5682，表明新月彎孢群體存在豐富的遺傳多樣性。5個地理種群的H值和I值的結(jié)果趨勢一致，河南和安徽省群體具有豐富的遺傳多樣性水平，江蘇省群體遺傳多樣性較低，可能與江蘇種群菌株數(shù)目較少有關(guān)。UPGMA聚類分析顯示，在相似系數(shù)0.59水平上，所有的菌株被分為2個大群5個亞群，2013、2016和2017年的菌株明顯聚為3支，分別分布于subgroupⅠ、subgroupⅡ、subgroupⅣ。但2013年有2個菌株分別分布于subgroupⅢ和subgroupⅤ，2016年有1個菌株分布于subgroupⅠ，基因流分析結(jié)果也表明，不同年度間種群存在一定的基因交流。遺傳相似性分析表明，年度間相同地理來源的菌群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相同年份不同地理來源菌群親緣關(guān)系較近。

3.2 玉米彎孢葉斑病的初侵染源分析

玉米彎孢葉斑病病菌主要通過氣流進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，以菌絲體或分生孢子隨病殘體越冬，有關(guān)越冬場所和越冬條件等也有很多相關(guān)研究報道。張定法[25]通過對病殘體上病原菌越冬存活檢測，表明在河南新鄉(xiāng)地區(qū)病菌的菌絲體在土壤10 cm處越冬率較低；暴增海等[26]對冀東地區(qū)玉米彎孢葉斑病菌的初侵染源進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該病原菌可隨病殘體在地表越冬，但存在于10—30 cm土層中的病殘體不能越冬；戴法超等[27]研究指出，干燥是病殘體中病菌存活和越冬的首要條件，在潮濕條件下病殘體容易腐爛，因此埋于土層的病殘體未分離到彎孢菌。近年來，由于黃淮海地區(qū)耕作制度的改變，多地均采取玉米秸稈深翻還田，而后進(jìn)行冬小麥種植的耕作措施。彎孢病菌隨含水量較高的病殘體被深翻埋于土層之中，而冬小麥的種植需進(jìn)行2—3次灌溉，因此，黃淮海地區(qū)的栽培模式未能提供病原菌越冬的適宜條件，本團(tuán)隊多年的田間調(diào)查表明該病的發(fā)生具有間歇性，且病斑從植株上部向中下部蔓延，具有病原菌的初侵染來源為外來菌源的特點(diǎn)，但并無相關(guān)研究證明。本研究結(jié)果表明，年度間相同地理來源的菌群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，相同年份不同地理來源菌群親緣關(guān)系較近，且不同年度間種群存在一定的基因交流。因此推測，黃淮海地區(qū)引起玉米彎孢葉斑病的新月彎孢菌株不是以本地菌源為主，同時存在少量存活于田間地表病殘體上的菌株可作為本地菌源在翌年進(jìn)行侵染。

徐輝[28]研究發(fā)現(xiàn)，新月彎孢可引起水稻彎孢葉斑病，且在安徽地區(qū)有蔓延的趨勢；在長江以南地區(qū)的水稻田，新月彎孢菌株還可以引起水稻葉鞘黑斑病、穗腐病、穗枯病等[29-32]；也可以引起幾種禾草草坪草的葉部病害[33-37]。因此南方地區(qū)冬季未處理的水稻帶菌稻秸和多年生草坪草等可能作為彎孢病菌的越冬場所，第二年病菌隨東南氣流進(jìn)入黃淮海玉米生產(chǎn)區(qū)，為該地區(qū)玉米彎孢葉斑病的發(fā)生提供初侵染菌來源；另一種可能是病菌隨臺風(fēng)來自東南亞玉米種植區(qū)。因此，下一步研究應(yīng)采集來自南方不同地區(qū)不同作物上的新月彎孢菌株進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 影響病菌變異及群體遺傳多樣性的因子

遺傳多樣性及聚類分析結(jié)果表明，年度間菌群遺傳差異較大，但遺傳多樣性與地理種群無關(guān)。推測可能是由于不是以本地菌源為主所導(dǎo)致；其次病原菌可能隨氣流或臺風(fēng)從不同菌源地遠(yuǎn)距離傳入黃淮海玉米種植區(qū)。同時病原菌變異較快的原因可能是由環(huán)境等外界因素所導(dǎo)致。

寄主品種和抗病性差異、栽培模式以及不同地域?qū)Σ≡倪z傳基因型、毒力表型具有顯著的影響[38-39]。劉二明對稻瘟病菌（）遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，水稻種植品種越多的地區(qū)，該地區(qū)的群體遺傳多樣性越豐富[40]；對于小麥銹菌（）和麥類白粉菌（）等專性寄生菌，由于周年循環(huán)過程需與寄主相互作用，因此寄主與病原菌之間也可產(chǎn)生互作、變異、適應(yīng)性改變等[41-42]。黃淮海地區(qū)玉米種植品種繁多，且本研究采取田間隨機(jī)采樣模式，因此寄主遺傳背景的差異可能會對彎孢病菌的基因型有一定影響。病原物、寄主與環(huán)境條件相互作用對病原菌的基因型也產(chǎn)生一定影響。病原菌菌絲體普遍為多核，且每個細(xì)胞核均能發(fā)育成為單個菌絲體[43-44]，這種現(xiàn)象有利于病菌遺傳差異的產(chǎn)生，且菌群結(jié)構(gòu)易受環(huán)境等外界因素的影響[45]，因此環(huán)境因素也是造成彎孢病菌年度間差異較大的原因之一。同時本研究中年度間菌群差異明顯，可能是由于年度間菌群不是以本地菌源為主所致，以及隨氣流或臺風(fēng)在高空漂移過程中，來自空中的各種輻射也是導(dǎo)致遺傳差異的一個重要因素[23,41]。

4 結(jié)論

黃淮海地區(qū)玉米彎孢葉斑病菌（新月彎孢）群體內(nèi)具有豐富的遺傳多樣性，即存在種內(nèi)遺傳分化現(xiàn)象。聚類分析表明，地域相鄰的新月彎孢遺傳關(guān)系較近，遺傳相似系數(shù)較高；同一地區(qū)的菌株在年度間表現(xiàn)出一定遺傳距離，遺傳相似系數(shù)較低。遺傳多樣性分析結(jié)果表明，引起玉米彎孢葉斑病的新月彎孢菌株不是以本地菌源為主，但也存在少量存活于地表病殘體上的菌株可作為翌年的初侵染源。

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Genetic Diversity Analysis ofin Summer Maize in Huang-Huai-Hai Region

CHANG JiaYing, LIU ShuSen, MA HongXia, SHI Jie, GUO Ning, ZHANG HaiJian

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture/IPM Centre of Hebei Province, Baoding 071000, Hebei)

【Objective】The objective of this study is to identify the genetic diversity and relationship of, the causal agent of maize Curvularia leaf spot occurred in different regions and years in Huang-Huai-Hai region via molecular techniques, and to provide scientific data for studying the occurrence and prevalence of the disease. 【Method】The samples collected from five provinces (Henan, Hebei, Shandong, Anhui and Jiangsu) in Huang-Huai-Hai region in 2013, 2016 and 2017 were separated and identified by morphology and molecular biology (ITS and EF-1sequence analysis). A total of 175strains were obtained. Thirteen highly polymorphic and reproducible ISSR primers were screened out from universal primers developed by Columbia University and were used to amplify the 175strains. Popgen32 software was used to calculate the polymorphism ratio, Shannon’s information index, genetic distance and genetic similarity among populations. UPGMA cluster analysis and principal coordinate analysis based on genetic similarity coefficient were carried out by NTsys 2.10e software, and cluster analysis map and scatter plot were constructed. 【Result】A total of 105 polymorphic bands were obtained with a polymorphism ratio of 100%. At the group average level, the level of genetic diversity (H) was 0.3867, and Shannon’s information index (I) was 0.5682, indicating that thehad abundant genetic diversity. The genetic diversity among different geographical populations was different. The genetic diversity of Henan and Anhui populations was the highest, and that of Jiangsu population was low. The flora of the same geographical origin was far away from each other during the year, and the flora from different geographical origins in the same year was relatively close. Cluster analysis showed that the similarity coefficients of all strains were 0.51-0.93. At the similarity coefficient of 0.59 level, 175 strains were divided into 2 groups and 5 subgroups. There were annual differences among the subgroups, gene exchanges among the different geographical populations, and the genetic correlation was high. The results of principal component analysis were consistent with those of cluster analysis, and the strains in the same year were obviously clustered together.【Conclusion】There was a high genetic variation in the pathogen populations causing maize Curvularia leaf spot disease in Huang-Huai-Hai region, and the genetic relationship of the adjacent pathogens was close. the strains from the same area showed a certain genetic distance in different years, while the genetic distance of strains of different geographical origins in the same year was close. The results of the analysis indicated that the main pathogen causing the leaf spot disease ofwas not mainly from local source, they probably came from the southern rice and turf grass or maize production areas of Southeast Asia, but occasionally a few strains that survived on the ground surface could be the initial source of infection in the following year.

Huang-Huai-Hai region; genetic diversity; ISSR

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.05.005

2018-10-27；

2018-12-23

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）

常佳迎，E-mail：cjy198908@163.com。通信作者石潔，E-mail：shij99@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）