邱雪迎，馬丹丹，趙偉全，李壽如，賈景麗，劉大群，3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001； 2.本溪市馬鈴薯研究所，遼寧 本溪 117000； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081)

馬鈴薯是位列小麥、水稻和玉米后的第四大主糧作物，在保證我國(guó)糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展方面具有重要作用。我國(guó)馬鈴薯的常年種植面積在560萬(wàn)hm2以上，總產(chǎn)量保持在9 000萬(wàn)t以上[1]，是世界生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó)。隨著我國(guó)馬鈴薯種植面積的逐年增加，病害對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)的影響日益突出，其中馬鈴薯瘡痂病作為典型的土傳與種傳病害，已在我國(guó)各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[2]。目前已知馬鈴薯瘡痂病可由多種植物病原鏈霉菌(Plant-pathogenicStreptomyces)引起，包括普通瘡痂鏈霉菌(S.scabies)[3]、酸性瘡痂鏈霉菌(S.acidiscabies)[4]、腫脹瘡痂鏈霉菌(S.turgidiscabies)[5]等10余種致病種，且不同致病種間的生物學(xué)特征有較大差別[6]。馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生與生長(zhǎng)環(huán)境有很大關(guān)系，尤其在重復(fù)使用蛭石為基質(zhì)生產(chǎn)微型薯過(guò)程中，瘡痂病的發(fā)病率很高，危害較重。有調(diào)查表明，在內(nèi)蒙古18個(gè)種薯生產(chǎn)單位瘡痂病的發(fā)病率高達(dá)83.0%[7]。盡管目前有些措施可有效預(yù)防微型薯瘡痂病，如利用霧培法、無(wú)土栽培等方式生產(chǎn)，但由于對(duì)技術(shù)設(shè)施要求較高和需要投入生產(chǎn)成本較多，很多生產(chǎn)單位較難采用，因此，多數(shù)還是以蛭石為基質(zhì)進(jìn)行微型薯生產(chǎn)。鑒于目前尚缺乏防治蛭石基質(zhì)中馬鈴薯瘡痂病的有效手段，本研究對(duì)蛭石基質(zhì)中的瘡痂病原菌進(jìn)行鑒定，針對(duì)病原菌篩選有效的抑菌藥劑，并結(jié)合前期獲得的生防制劑在蛭石苗床上進(jìn)行菌藥協(xié)同防治試驗(yàn)，旨在探索馬鈴薯瘡痂病防治的新途徑。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和菌劑

供試菌株包括分離自遼寧本溪微型薯病斑上的瘡痂病原鏈霉菌LNB-1、LNB-2、LNB-3，已全部完成柯赫氏法則驗(yàn)證，均為瘡痂病致病菌株；瘡痂病原鏈霉菌S.scabies的典型菌株CPS-1；生防菌劑ZWQ-1水劑為前期制備，活菌含量為1.0×109cfu/mL。

1.2 供試藥劑

所用測(cè)試藥劑共29種，具體信息見(jiàn)表1。

表1 29種藥劑的有效成分、含量及生產(chǎn)廠家Tab.1 The active components,contents and manufacturers of 29 pesticides

續(xù)表1 29種藥劑的有效成分、含量及生產(chǎn)廠家Tab.1(Continued) The active components,contents and manufacturers of 29 pesticides

1.3 微型薯瘡痂病原菌的分子鑒定

采用CTAB法[8]提取3個(gè)菌株的基因組DNA，采用鏈霉菌16S rRNA基因的通用引物16S1(5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′)和16S2( 5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC- 3′)擴(kuò)增，將獲得的片段交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。序列經(jīng)校對(duì)后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選取相似性較高的菌株和瘡痂病原鏈霉菌的典型菌株，利用MEGA 5.0軟件對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行聚類分析，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定。

1.4 皿內(nèi)抑菌藥劑與菌藥協(xié)同組合篩選

采用紙碟法[9]進(jìn)行皿內(nèi)抑菌藥劑篩選。將馬鈴薯瘡痂病菌S.scabies菌株CPS-1制成105cfu/mL的孢子懸浮液，用微量移液器吸取30 μL涂布OMA平板，在培養(yǎng)皿中央放置直徑6 mm的無(wú)菌濾紙片，分別將29種測(cè)試藥劑用無(wú)菌水配制成不同初篩濃度(表1)，取5 μL加至培養(yǎng)皿的濾紙片上，于28 ℃倒置培養(yǎng)5 d后測(cè)量抑菌圈大小，每種藥劑3次重復(fù)，以無(wú)菌水為對(duì)照。根據(jù)結(jié)果將活性較好的藥劑稀釋成不同的濃度梯度，采用紙碟法進(jìn)行最低有效濃度測(cè)定(方法同前)。然后將有抑菌效果的藥劑與ZWQ-1生防菌劑進(jìn)行組合培養(yǎng)測(cè)試，確定可協(xié)同使用的藥劑。

1.5 微型薯苗床防治試驗(yàn)

防治試驗(yàn)在遼寧本溪馬鈴薯研究所日光溫室的微型薯擴(kuò)繁苗床中進(jìn)行，測(cè)試所用馬鈴薯品種為春季收獲的尤金試管苗原原種，所用基質(zhì)為春季使用過(guò)且有瘡痂病發(fā)生的舊蛭石。每個(gè)苗床長(zhǎng)8.0 m、寬1.5 m，每個(gè)小區(qū)2.0 m2。按照行距6.0 cm、株距5.0 cm、播種深度10.0 cm種植。選用室內(nèi)藥劑篩選中有明顯抑菌效果的藥劑進(jìn)行處理，以清水處理為對(duì)照。在馬鈴薯齊苗后，株高8.0 cm左右開(kāi)始施藥，此后每隔7 d處理1次，共處理3次。每次處理時(shí)將藥劑用10 L水充分溶解后灌根，其他管理照常，微型薯成熟后收獲并分別調(diào)查發(fā)病情況。

馬鈴薯瘡痂病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，薯塊表面無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占薯塊面積≤5%；2級(jí)，病斑面積占薯塊面積的5%～10%；3級(jí)，病斑面積占薯塊面積的10%～20%；4級(jí)，病斑面積占薯塊面積的20%～40%；5級(jí)，病斑面積占薯塊面積的40%～65%；6級(jí)，病斑面積占薯塊面積的65%以上。

發(fā)病率=發(fā)病粒數(shù)/收獲小薯粒數(shù)×100%，病情指數(shù)=∑(病級(jí)粒數(shù)×發(fā)病級(jí)別)/(調(diào)查收獲粒數(shù)×發(fā)病最高級(jí)別)×100，防治效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 微型薯瘡痂病菌的分子鑒定結(jié)果

通過(guò)對(duì)瘡痂病菌LNB-1、LNB-2和LNB-3進(jìn)行基因組DNA提取，利用引物16S1/16S2擴(kuò)增后，得到約1.5 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)回收測(cè)序和序列校對(duì)后，確定片段長(zhǎng)度為1 460 bp。在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)菌株與S.scabies最為相似，同源性均大于99%，通過(guò)構(gòu)建不同瘡痂病菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定獲得的3個(gè)菌株均屬于S.scabies(圖1)。

A：16S rRNA基因擴(kuò)增(M：Marker；1：LNB-1 菌株；2：LNB-2 菌株；3：LNB-3菌株)；B：系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) A: 16S rRNA gene amplification (M: Marker; 1: LNB-1 strain; 2: LNB-2 strain; 3: LNB-3 strain)； B: Phylogenetic tree圖1 瘡痂病菌16S rRNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果Fig.1 16S rRNA gene amplification and phylogenetic tree construction of scab pathogen

2.2 室內(nèi)抑菌藥劑篩選結(jié)果

采用濾紙片法對(duì)29種藥劑進(jìn)行初步測(cè)試，發(fā)現(xiàn)對(duì)瘡痂病菌CPS-1抑制效果較好的藥劑有8種。對(duì)這8種藥劑所含有效成分的最低有效濃度進(jìn)行梯度篩選，結(jié)果表明，適樂(lè)時(shí)0.1 g/L的抑菌圈直徑最大，為41 mm；其次為福美雙0.35 g/L、百菌清0.28 g/L和72%農(nóng)用鏈霉素0.56 g/L，其抑菌圈直徑分別為39 mm、39 mm和36 mm；四霉素0.1 g/L、氰烯菌酯0.125 g/L、三唑酮0.1 g/L和億度勇0.2 g/L的抑菌效果相對(duì)較差，抑菌圈直徑分別為25 mm、24 mm、22 mm和14 mm(圖2)；其余21種藥劑抑菌效果很差。將獲得的8種藥劑與生防菌劑ZWQ-1水劑進(jìn)行組合培養(yǎng)測(cè)試，結(jié)果表明，適樂(lè)時(shí)和福美雙可以與生防菌劑共同使用。

2.3 微型薯苗床防治試驗(yàn)結(jié)果

將篩選到的菌藥協(xié)同組合、其他抑菌藥劑、ZWQ-1水劑、檸檬酸及農(nóng)用EDTA等用于微型薯苗床防治試驗(yàn)。在收獲前對(duì)植株生長(zhǎng)情況調(diào)查(圖3)發(fā)現(xiàn)，清水對(duì)照有較多植株枯死；ZWQ-1水劑和福美雙+ZWQ-1水劑處理的植株長(zhǎng)勢(shì)良好；而72%農(nóng)用鏈霉素、適樂(lè)時(shí)+ZWQ-1水劑、百菌清、檸檬酸和四霉素等處理均有部分植株出現(xiàn)黃化和死亡，但整體上植株生長(zhǎng)狀況好于對(duì)照區(qū)；農(nóng)用EDTA、億度勇、氰烯菌酯和三唑酮處理植株均有大面積死亡發(fā)生，分析原因可能與施藥后未能及時(shí)沖洗掉葉片殘留的藥劑有關(guān)。瘡痂病的防效評(píng)價(jià)是對(duì)新生薯塊的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，植株的損傷對(duì)防效的影響相對(duì)較小，因此試驗(yàn)可以繼續(xù)進(jìn)行。待微型薯全部收獲后，對(duì)所有薯塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明：清水對(duì)照薯塊發(fā)病率為70.90%；適樂(lè)時(shí)+ZWQ-1水劑和福美雙+ZWQ-1水劑處理的發(fā)病率分別為26.23%和30.83%，對(duì)病害的防治效果分別為72.60%和57.92%；ZWQ-1水劑、百菌清、四霉素和檸檬酸處理的發(fā)病率分別為47.47%、52.31%、62.16%和66.67%，防效均較低，分別為33.26%、23.68%、24.75%和19.11%；其余處理效果均很差(表2)。說(shuō)明藥劑適樂(lè)時(shí)和福美雙與ZWQ-1水劑協(xié)同使用對(duì)瘡痂病具有明顯的防治效果，較具應(yīng)用潛力。

A：褔美雙0.35 g/L； B：農(nóng)用鏈霉素0.56 g/L；C：適樂(lè)時(shí)0.1 g/L；D：四霉素0.1 g/L；E：氰烯菌酯0.125 g/L；F：億度勇0.2 g/L；G：三唑酮0.1 g/L；H：百菌清0.28 g/L A: Thiram 0.35 g/L； B：Streptomycin 0.56 g/L；C：Shileshi 0.1 g/L；D：Fourmycin 0.1 g/L；E：Cyanenide 0.125 g/L；F：Yiduyong 0.2 g/L；G：Three azolone 0.1 g/L；H：Chlorothalonil 0.28 g/L圖2 不同藥劑對(duì)瘡痂病菌CPS-1菌株的抑菌測(cè)試結(jié)果Fig.2 Antibacterial test results of different agents against the CPS-1 strain

圖中為生長(zhǎng)后期的植株長(zhǎng)勢(shì)與收獲后隨機(jī)抽取的新生微型薯樣品，各處理分別為A：清水對(duì)照；B：ZWQ-1菌劑；C：72%農(nóng)用鏈霉素； D：適樂(lè)時(shí)+ZWQ-1水劑；E:百菌清；F：福美雙+ ZWQ-1水劑；G：檸檬酸；H：EDTA；I：四霉素；J：億度勇；K：氰烯菌酯；L：三唑酮Picture shows the plant growth at the late growth stage and a random sample of new-born micro-potatoes taken after harvest. The treatments were as follows, A: Clear water control; B: ZWQ-1 water agent; C: 72% Streptomycin; D: Shileshi + ZWQ-1; E: Chlorothalonil; F: Thiram +ZWQ-1; G: Citric acid; H: EDTA； I: Fourmycin; J: Yiduyong; K: Cyanenide； L: Three azolone圖3 微型薯收獲時(shí)不同處理植株生長(zhǎng)與瘡痂病發(fā)生情況Fig.3 The plant growth and minituber scab occurrence state of different treatments at harvest time

處理 Treatments每升用量Dosage in 1 L各病級(jí)微型薯粒數(shù)Minituber number of each disease grade012 3456發(fā)病率/%Morbidity病情指數(shù)Disease index防治效果/% Control efficiencyZWQ-1水劑ZWQ-1 water agent0.25 L104252220186347.4729.9633.26b72%農(nóng)用鏈霉素72% Streptomycin6.0 g281289521258.8234.4814.28c適樂(lè)時(shí)+ZWQ-1水劑Shileshi+ZWQ-15.0 mL+0.25 L90127454226.2312.3072.60a百菌清Chlorothalonil25.0 g10311231518163052.3134.2623.68bc福美雙+ZWQ-1水劑Thiram+ZWQ-120.0 g+0.25 L8345778630.8318.8957.92a檸檬酸Citric acid150.0 g411818912111466.6736.3119.11bcEDTA 70.0 g201296781072.2240.749.24c四霉素Fourmycin5.0 mL28713855862.1633.7824.75bc億度勇Yiduyong2.0 g2331384854.0038.0015.35c氰烯菌酯 Cyanenide8.0 mL94181588586.5746.52—三唑酮Three azolone6.0 mL4328661290.2463.82—清水對(duì)照Clear water control—559281729292270.9044.89

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

隨著馬鈴薯種植面積的增加和多年連作，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生日益加重，已成為馬鈴薯生產(chǎn)的主要問(wèn)題。馬鈴薯瘡痂病發(fā)生的隱蔽性較強(qiáng)，給防治帶來(lái)較大困難。在以蛭石基質(zhì)生產(chǎn)微型薯時(shí)，由于其形成的特殊環(huán)境非常有利于瘡痂病發(fā)生，致使微型薯的發(fā)病率非常高。目前對(duì)該病害的發(fā)生機(jī)制和影響因素還不十分清楚，僅知其具有土傳和種傳病害的基本特征。對(duì)該病害的防治還停留在多方探索階段，人們?cè)谝志巹?、施藥方法及生物因子防治等方面進(jìn)行了研究。李青青等[10]通過(guò)澆灌防治的方法發(fā)現(xiàn)，53.8%可殺得2000的600倍液對(duì)脫毒薯瘡痂病的防效為51.37%，20%五氯硝基苯可濕性粉劑1 000倍液的防效為39.75%。于勤良等[11]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)用氯化苦熏蒸處理，帶病種薯播種前用0.1%對(duì)苯二酚處理30 min，防效較好。李玉聰?shù)萚12]獲得1株對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)，并將其用于溫室盆栽防治試驗(yàn)，測(cè)試其防效為40.27%～48.66%。劉萍萍[13]采用生防鏈霉菌CC5-6菌懸液在盆栽試驗(yàn)薯塊形成初期灌根防治馬鈴薯瘡痂病，防治效果為33.9%。奚啟新等[14]發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)土壤pH值至5.0以下或7.69以上對(duì)瘡痂病菌有一定抑制作用。此外，還有很多其他措施被用于探索馬鈴薯瘡痂病的防治，如消毒、調(diào)節(jié)不同基質(zhì)、施用生物有機(jī)肥等[15-19]。

盡管多種措施在馬鈴薯微型薯瘡痂病防治方面已經(jīng)取得一定的效果，但防效普遍不高，說(shuō)明單純利用一種措施防治很難達(dá)到理想的效果。此外，由于馬鈴薯瘡痂病可由多種病原鏈霉菌引起，在防治中確定病原菌的種類是重要前提，以便開(kāi)展針對(duì)性防治。因此，本研究中首先對(duì)微型薯苗床的瘡痂病原種類進(jìn)行了鑒定，確定為致病種S.scabies后再針對(duì)其篩選抑菌藥劑，并結(jié)合前期獲得的生防菌株[20]形成菌藥協(xié)同組合，確定用量后進(jìn)行苗床防治試驗(yàn)。結(jié)果顯示，適樂(lè)時(shí)、福美雙分別與生防菌劑ZWQ-1水劑的組合處理可顯著降低瘡痂病的發(fā)病程度，防效為72.60%和57.92%，而單純使用ZWQ-1水劑的防效與其他報(bào)道的效果相差不大，為33.26%。此外，菌藥協(xié)同處理對(duì)微型薯植株生長(zhǎng)表現(xiàn)出較好的促進(jìn)作用。說(shuō)明在馬鈴薯瘡痂病防治中將生防制劑和化學(xué)藥劑恰當(dāng)組合使用會(huì)取得防病、促生長(zhǎng)的雙重效果。本研究為馬鈴薯瘡痂病的防治探索了一條新途徑，具體菌藥協(xié)同防病促生的原因和作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。