王 莉，張 杰，趙賢亮，狄桂蘭，孔祥會

( 1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.河南師范大學 水產學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

1 魚類C-型凝集素

C-型凝集素是最早被發(fā)現(xiàn)的動物凝集素之一。C-型凝集素家族成員膠固素在牛血清中最先被發(fā)現(xiàn)[26]。起初認為C-型凝集素是一類依賴Ca2+的糖結合蛋白。隨著研究的深入，不同結構和功能的C-型凝集素被逐漸確定，發(fā)現(xiàn)并不是所有的C-型凝集素均依賴Ca2+。魚類有些C-型凝集素發(fā)揮功能，并不依賴Ca2+ [13]。C-型凝集素的重要特征是具有糖識別結構域，且在糖識別結構域中存在高度保守的基序。晶體結構分析發(fā)現(xiàn)，C-型凝集素的糖識別結構域具有特殊的球狀結構，而其他已知的蛋白中不存在該類型的結構域。因此，糖識別結構域的存在是判定其為C-型凝集素的標準[27-28]。目前一般認為，魚類C-型凝集素是一類至少含有一個糖識別結構域的蛋白超家族。即使有些C-型凝集素并不能結合糖，但只要含有與糖識別結構域相似結構域的蛋白，均可稱為C-型凝集素[29]。

2 魚類C-型凝集素亞家族

Drickamer等[30]根據脊椎動物C-型凝集素的進化、結構及功能的相關性將其分為7個亞家族(Ⅰ～Ⅶ)。隨著研究逐步深入，至2002年增加至14個亞家族(Ⅷ～ⅩⅣ)[31]。Zelensky等[32]基于紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)基因組相關研究又發(fā)現(xiàn)3個亞家族(ⅩⅤ～ⅩⅦ)。因此，脊椎動物C-型凝集素依據其結構域元件組成不同，可分為17個亞家族。Zelensky等[32]通過對紅鰭東方鲀進行基因組測序及分析比對，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀中含有與脊椎動物C-型凝集素相對應的15個亞家族，每個亞家族擁有與脊椎動物相同的成員，但未發(fā)現(xiàn)與脊椎動物C-型凝集素Ⅴ和Ⅶ亞家族相對應的成員。進一步通過序列比對和進化樹構建，發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀C-型凝集素中的某些亞家族的成員，如硫酸軟骨蛋白多糖家族成員，與脊椎動物相比高度保守。

3 魚類C-型凝集素的蛋白結構特征

脊椎動物C-型凝集素蛋白晶體結構表明，糖識別結構域由110～130個氨基酸殘基構成，具有獨特的緊密球形結構[29]。該結構域含有雙環(huán)結構(圖1)，整體是1個由N-端和C-端2個β折疊(β1和β5)構成的反向平行的β-片層；第2個環(huán)狀結構被稱為“長環(huán)”區(qū)域，位于整個結構域的內部，延伸到核心區(qū)，是糖識別結構域與Ca2+和糖類結合相關的部位。2個環(huán)狀結構的基部由4個高度保守的半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)形成的二硫鍵連接，其中C1和C4連接整體環(huán)狀結構的β5和α1，C2和C3連接“長環(huán)”區(qū)域的β3和β5。其余肽段則形成兩個側翼的α螺旋結構(α1和α2)及第2個反向平行的β-片層(β2、β3和β4)[27]。采用SWISS-MODLE軟件預測松江鱸C-型凝集素的三維結構，發(fā)現(xiàn)松江鱸C-型凝集素的糖識別結構域為雙環(huán)結構的緊密球形結構(圖2)。雙環(huán)結構的基部由4個半胱氨酸殘基(C1、C2、C3和C4)形成的二硫鍵連接；“長環(huán)”區(qū)域為糖識別結構域與Ca2+和糖類結合相關的部位。預測結構與脊椎動物C-型凝集素的蛋白晶體結構極其相似[16](圖2)。氨基酸序列比對結果表明，許多魚類C-型凝集素的糖識別結構域中均存在4個高度保守的半胱氨酸殘基，形成的二硫鍵對于構建和穩(wěn)固C-型凝集素的雙環(huán)結構發(fā)揮重要作用[22,33]。

部分C-型凝集素的糖識別結構域在多肽鏈N-端含有1個功能未知的β-發(fā)夾結構，該結構由1對半胱氨酸殘基(C0和C0′)形成的二硫鍵固定。據此將糖識別結構域分為兩類：含有該β-發(fā)夾結構及半胱氨酸殘基(C0和C0′)的糖識別結構域被稱作“長型”糖識別結構域，而不含這對半胱氨酸殘基的糖識別結構域被稱為“短型”糖識別結構域[27,34-35]。“長型”糖識別結構域在斜帶石斑魚、松江鱸、香魚(Plecoglossusaltivelis)及大黃魚C-型凝集素中均有報道[11,16,18,22]。

圖1 C-型凝集素的糖識別結構域三級結構[29]藍色為“長環(huán)”區(qū)域，橙色棒狀結構為半胱氨酸形成的二硫鍵.“長型”糖識別結構域的β-發(fā)夾結構(β1′)和二硫鍵(C0和C0′)均有顯示.

圖2 松江鱸C-型凝集素糖識別結構域的預測三級結構[16]

4 C-型凝集素糖識別結構域的Ca2+結合位點和關鍵基序與糖結合的特異性

X射線晶體學和位點突變等方法為研究糖識別結構域與糖結合機制提供了很大幫助，對多個C-型凝集素結構的分析發(fā)現(xiàn)，糖識別結構域含有4個Ca2+結合位點[29,38-39]。其中Ca2+結合位點2是C-型凝集素結合糖的重要部位。C-型凝集素對糖的識別活性和結合特異性主要取決于Ca2+結合位點2的質子供體和質子受體的位置。與Ca2+結合的氨基酸殘基通過側鏈的羰基與Ca2+和糖形成復合體，這些氨基酸殘基構成了兩組關鍵的氨基酸基序[29]。

以大鼠甘露糖結合蛋白A為例，第一組關鍵的氨基酸基序是谷氨酸—脯氨酸—天冬酰胺(EPN)。該基序位于“長環(huán)”結構區(qū)域，谷氨酸和天冬酰胺被脯氨酸分離并分布于同側。谷氨酸和天冬酰胺通過與位于D-甘露糖赤道軸的3-OH和4-OH結合形成氫鍵，同時與Ca2+形成兩個配位鍵[27]。在該位點上，還可存在另一種關鍵的氨基酸基序是谷氨酰胺—脯氨酸—天冬氨酸(QPD)，谷氨酰胺和天冬氨酸通過與D-半乳糖徑向軸的3-OH和赤道軸的4-OH結合形成氫鍵，同樣也能與Ca2+形成兩個配位鍵。蛋白晶體結構學的研究表明，關鍵的氨基酸基序EPN或QPD并沒有使Ca2+結合位點2的結構發(fā)生重大變化，變化的關鍵在于交換了與糖配體結合平面上的質子供體和質子受體的位置，進而將氫鍵的結合從非對稱的甘露糖轉換成了對稱的半乳糖[40]。對多種C-型凝集素突變體結合特異性的研究表明，僅將C-型凝集素中關鍵的氨基酸基序EPN突變?yōu)镼PD，就可改變凝集素的糖結合特異性[41]。

第二組關鍵的氨基酸基序是位于β4的色氨酸—天冬酰胺—天冬氨酸(WND)，其中天冬酰胺和天冬氨酸能與Ca2+相互作用，同時也能與糖的羥基形成氫鍵。而且色氨酸是一個非常保守的氨基酸殘基，有助于疏水中心的形成。

5 魚類C-型凝集素的免疫功能

C-型凝集素家族為一類重要的模式識別受體，通過識別微生物表面的糖類結構，引發(fā)凝集微生物、誘導吞噬、激活補體等過程[42-43]，并隨著特異性免疫的出現(xiàn)而參與調節(jié)特異性免疫[44]。目前關于魚類C-型凝集素免疫功能的研究進展及相關物種見表1。

5.1 C-型凝集素對病原相關分子模式的識別與結合

魚類C-型凝集素通過其糖識別結構域識別與結合微生物表面的脂多糖、肽聚糖、甘露糖及葡聚糖等糖類結構的病原相關分子模式。通過糖類抑制C-型凝集素對細菌凝集或紅細胞凝集來間接反映C-型凝集素可結合的糖類；也可通過酶聯(lián)免疫吸附試驗直接檢測C-型凝集素與糖類結構的結合能力。

2016年，自許氏平鲉中獲得一種僅含一個糖識別結構域的C-型凝集素，可凝集魚類病原菌腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)和創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)。但在甘露糖存在的情況下，會抑制其對致病菌的凝集能力。因此，推測該凝集素可能是通過識別與結合甘露糖來實現(xiàn)對腸道弧菌和創(chuàng)傷弧菌的結合與凝集[23]。同年，大黃魚中發(fā)現(xiàn)1種C-型凝集素蛋白，可廣泛凝集革蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)及溶藻弧菌(V.alginolyticus)。但在脂多糖存在的條件下，其凝集能力會減弱甚至消失。因此，推測此凝集素是通過識別革蘭氏陰性菌表面的脂多糖進而凝集致病菌，從而抑制致病菌對魚體的侵染[22]。

本課題組自淇河鯽魚中克隆獲得1種C-型凝集素，構建大腸桿菌表達載體獲得其重組蛋白。酶聯(lián)免疫吸附試驗表明，該C-型凝集素的重組蛋白可與脂多糖及肽聚糖發(fā)生識別及結合作用，且對脂多糖的結合能力強于肽聚糖[33]。

5.2 C-型凝集素與紅細胞或致病微生物的凝集作用

能夠凝集紅細胞是C-型凝集素的基本特征。多種魚類的C-型凝集素能凝集人、家兔及魚類的紅細胞。有些C-型凝集素依賴Ca2+，才能發(fā)揮凝集紅細胞的能力，有些則不需要。例如，從納氏海蟾魚(Thalassophrynenattereri)體內分離到1種C-型凝集素，具有不依賴Ca2+凝集人紅細胞的能力[13]。而斜帶石斑魚C-型凝集素的重組蛋白必須在Ca2+存在的條件下才能凝集家兔紅細胞[11]；大黃魚中獲得1種僅含單個糖識別結構域的C-型凝集素，在Ca2+存在的條件下，其重組蛋白能凝集人、家兔和大黃魚的紅細胞，對人和大黃魚的紅細胞凝集活性較強[22]。

除了可以凝集紅細胞，魚類C-型凝集素對大量的致病微生物，包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌均能產生凝集作用。松江鱸C-型凝集素的重組表達蛋白在Ca2+存在條件下，既可以凝集革蘭氏陰性菌大腸桿菌、鰻弧菌(V.anguillarum)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)；還可以凝集革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensi)和真菌釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[16]。大黃魚的C-型凝集素重組蛋白在Ca2+存在條件下，可凝集所有的受試微生物包括4種革蘭氏陰性菌和3種革蘭氏陽性菌[22]。2015年，自半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)中克隆得到1個單糖識別結構域的C-型凝集素。該凝集素可凝集鰻弧菌和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)。其糖識別結構域中的保守基序EPN若發(fā)生突變，就會失去凝集鰻弧菌和藤黃微球菌的能力[17]。因此，推測該凝集素保守基序在凝集致病菌中發(fā)揮了關鍵作用。綜上所述，魚類C-型凝集素通過對致病菌的識別與凝集，可以在一定程度上減弱致病菌對魚體的侵襲與感染，也可以引發(fā)下游的免疫效應，如增強免疫細胞的吞噬能力，激活補體系統(tǒng)，清除體內病原菌等。

5.3 C-型凝集素可增強免疫細胞的吞噬能力

魚類C-型凝集素可以增強巨噬細胞吞噬能力，激活中性粒細胞，刺激淋巴細胞的增殖，參與免疫調節(jié)。大菱鲆C-型凝集素可以刺激腎臟淋巴細胞增殖，增強巨噬細胞對細菌的殺傷力[9]。斑馬魚甘露糖結合凝集素(1種C-型凝集素)能夠促進鯉巨噬細胞對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的吞噬作用[45]。利用離子交換層析法，Lopesferreira等[13]從納氏海蟾魚體內分離到1個分子量僅為15 ku的C-型凝集素。體外試驗發(fā)現(xiàn)，該凝集素可以激活小鼠(Musmusculus)的中性粒細胞，具有免疫調節(jié)功效。

在香魚的頭腎和外周血中鑒定獲得1個跨膜的C-型凝集素受體，其可與白細胞衍生趨化因子2發(fā)生相互作用，推測該C-型凝集素受體可能通過與白細胞衍生趨化因子2的結合作用，影響中性粒細胞趨化作用而介導細胞免疫[18]。將白細胞衍生趨化因子2的重組蛋白加入香魚的單核及巨噬細胞，結果單核及巨噬細胞中細胞因子的mRNA表達水平包括白介素-1β、白介素-10、腫瘤壞死因子-α及粒細胞集落刺激因子均顯著增加；增強了單核及巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬能力和殺傷能力。但是，若加入白細胞衍生趨化因子2重組蛋白的同時再加入抗香魚C-型凝集素受體的抗體(封閉C-型凝集素受體的胞外區(qū))，上述的單核及巨噬細胞中細胞因子的mRNA表達水平以及對大腸桿菌的吞噬能力和殺傷能力顯著降低。說明香魚的這種C-型凝集素受體介導了白細胞衍生趨化因子2對香魚的單核及巨噬細胞的免疫調控作用[19]。

自許氏平鲉中鑒定得到的1種C-型凝集素可提高頭腎中巨噬細胞對創(chuàng)傷弧菌的吞噬能力。在體試驗證明，感染創(chuàng)傷弧菌的許氏平鲉經過該凝集素重組蛋白處理，與對照組(未經該凝集素重組蛋白處理)相比，腎臟中創(chuàng)傷弧菌的數量明顯減少。說明許氏平鲉C-型凝集素具備明顯的免疫調節(jié)機能，在宿主防御致病菌入侵過程中發(fā)揮了重要作用[23]。

5.4 激活補體途徑

甘露糖結合凝集素作為C-型凝集素家族的一名特殊成員[46-47]，通過自身的糖識別結構域與微生物表面的糖基結合，活化甘露糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶，進而激活補體系統(tǒng)[48-55]。

綜上所述，甘露糖結合凝集素相關研究主要集中于基因克隆、組織表達、致病菌感染后的免疫響應及影響致病菌凝集和吞噬等方面。然而關于甘露糖結合凝集素與甘露糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶是否可以結合，結合后如何激活補體系統(tǒng)啟動先天免疫，仍需進一步深入研究。

表1 魚類C-型凝集素的免疫功能

6 展 望

目前，魚類C-型凝集素相關的研究主要集中于其對病原相關分子模式的識別與結合，引發(fā)致病菌凝集，增強巨噬細胞對致病菌的吞噬能力等方面。研究表明，病原菌感染魚體后，魚類C-型凝集素可發(fā)揮重要的免疫作用。今后應深入研究C-型凝集素增強魚體免疫和防病的分子機制，探明C-型凝集素參與魚體免疫和防病的機理，開發(fā)新型漁用抗菌劑，以有效防控魚類細菌性疾病的發(fā)生。