江紅霞，凌潔彬，葉凱甲，李學軍

( 河南師范大學 水產(chǎn)學院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，大量的重金屬廢棄物流入河流、湖泊和水庫等水域中，對水域生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的污染。在水環(huán)境中，重金屬離子先富集于底泥中，然后被浮游生物富集，再通過食物鏈進入魚體大量蓄積，并最終進入人體，對人體的生長發(fā)育造成危害，甚至危及人類的生命安全。為保護水生態(tài)環(huán)境，并最終保護人類的健康，研究重金屬對魚類的毒性作用具有非常重要的意義。重金屬銅(Cu)是魚類必需的微量元素之一，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常用藥物成分，但過量的銅又對魚類有毒害作用，會損傷魚類的神經(jīng)生理功能，破壞嗅覺器官的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)分泌等[1-2]。重金屬鎘(Cd)是生物機體非必需元素之一，其毒性極強，痕量鎘的短期脅迫就可對魚類產(chǎn)生毒性效應及其他生物學效應，導致魚類各組織器官出現(xiàn)損害，從而對其生長發(fā)育及生殖造成影響[3-4]。

草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國特有的淡水性魚類，為我國四大家魚之一，是人工養(yǎng)殖的主要種類之一，每年產(chǎn)量居于世界前列。目前有關(guān)草魚的研究主要集中在營養(yǎng)價值、轉(zhuǎn)基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，有關(guān)養(yǎng)殖水環(huán)境重金屬污染對草魚的毒性效應的研究也有較多報道[5-9]，但水環(huán)境重金屬銅和鎘對草魚免疫系統(tǒng)的破壞以及對其免疫基因表達的影響均未見報道。筆者主要研究水體中不同含量的Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟組織中3種免疫基因——白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達的影響，以期為研究重金屬對魚類的免疫毒性機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及飼養(yǎng)管理

試驗魚購自新鄉(xiāng)市水產(chǎn)市場，體長(8.0±1.0) cm、體質(zhì)量(10.0±1.0) g，實驗室暫養(yǎng)7 d后進行試驗。試驗容器為100 cm×50 cm×40 cm的200 L塑料水箱，每箱放水100 L，放魚10尾。試驗期間使用小型增氧機增氧，溶解氧>9 mg/L，光暗周期為12L∶12D，水溫為(26±2) ℃，pH 7～8。每日投喂市售商品飼料1～2次，并及時清除殘餌及糞便。

1.2 重金屬處理

將分析純CuSO4·5H2O和CdCl2·2.5H2O用去離子水配制成1 g/L的母液。按照國家漁業(yè)水質(zhì)標準中Cu2+的質(zhì)量濃度≤0.01 mg/L以及Cd2+的質(zhì)量濃度≤0.005 mg/L，重金屬Cu2+和Cd2+分別設(shè)置了5個質(zhì)量濃度梯度。Cu2+的質(zhì)量濃度梯度分別0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/L(依次為國家漁業(yè)水質(zhì)標準允許質(zhì)量濃度的10、20、40、60、80倍)；Cd2+的質(zhì)量濃度梯度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L(依次為國家漁業(yè)水質(zhì)標準允許質(zhì)量濃度的10、20、40、60、80倍)。對照組中不添加CuSO4·5H2O和CdCl2·2.5H2O，Cu2+和Cd2+的質(zhì)量濃度均以0.00 mg/L計。試驗期間，日換水1次，使Cu2+和Cd2+的質(zhì)量濃度保持穩(wěn)定。并分別于暴露2、4、6 d和8 d后在每個處理組和對照組中隨機采集5尾試驗魚，冰盤解剖，取出草魚完整的腎臟(包括頭腎和中腎)，液氮迅速冷凍后置于冰箱-80 ℃保存。

1.3 RNA提取

按試劑盒Total RNA kit Ⅱ(Omega 公司)的說明書提取各處理組草魚腎臟組織的總RNA。利用NanoDrop 2000c微量紫外分光光度計(Thermo，美國)測定RNA的含量和純度，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.4 實時熒光定量PCR

使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒對各樣品的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應。將反轉(zhuǎn)成的第一鏈cDNA置于-20 ℃保存。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計用于實時熒光定量PCR的特異性引物(表1)，引物設(shè)計所依據(jù)的基因模板序列來源于美國國立生物技術(shù)信息中心cDNA數(shù)據(jù)庫。以β-肌動蛋白基因作為內(nèi)參基因，使用CFX96實時熒光PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)試劑進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系(25 μL)為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個重復，依據(jù)2-ΔΔCt法分析試驗樣本中3種白細胞介素基因的相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示, 采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學檢驗, 利用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學顯著性水平設(shè)定為0.05。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

注：引物名稱中IL為白細胞介素，β-actin為β-肌動蛋白.

2 結(jié) 果

2.1 銅和鎘對草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達的影響

在0.80 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；在其他各質(zhì)量濃度的Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖1a)。在6 d時，0.40、0.60 mg/L暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質(zhì)量濃度Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

在0.05 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于4 d暴露組(P<0.05)；在0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于2、4、6 d暴露組(P<0.05)；在0.10 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖1b)。在6 d時，0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質(zhì)量濃度Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同質(zhì)量濃度Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟中白細胞介素-1β 基因表達的影響不同小寫字母代表同一暴露質(zhì)量濃度的不同暴露時間組之間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；*代表同一暴露時間的不同暴露質(zhì)量濃度組與對照組相比差異顯著(P<0.05).其他圖同.

2.2 銅和鎘對草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達的影響

在0.10 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；在0.40 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2、4、6 d暴露組(P<0.05)；在0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露下，4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；在0.20 mg/L Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖2a)。在4、6 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.40、0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

在0.05 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于4 d暴露組(P<0.05)；在0.10 mg/L Cd2+暴露下，6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2、4 d暴露組(P<0.05)；在0.20、0.30 mg/L Cd2+暴露下，6 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量顯著高于2、4 d暴露組(P<0.05)；在0.40 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖2b)。在2、4 d時，0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在6、8 d時，0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖2 不同質(zhì)量濃度Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達的影響

2.3 銅和鎘對草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達的影響

在0.60 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于2、4、6 d暴露組(P<0.05)；在0.80 mg/L Cu2+暴露下，6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于2 d暴露組(P<0.05)；0.10、0.20、0.40 mg/L Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖3a)。在6 d時，0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在8 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質(zhì)量濃度Cu2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同質(zhì)量濃度Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達的影響

在0.20 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于2、4 d暴露組(P<0.05)；在0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下，6 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均顯著高于2、4、8 d暴露組(P<0.05)；在0.05、0.10 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均無顯著差異(P>0.05)(圖3b)。在6、8 d時，0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；在2、4 d時，各質(zhì)量濃度Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)暴發(fā)性病害的相繼發(fā)生引起了養(yǎng)殖魚類的大規(guī)模死亡，造成了漁業(yè)生產(chǎn)的巨大經(jīng)濟損失。病害發(fā)生的原因之一就是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中排放的大量污水使得養(yǎng)殖水域污染不斷加重，水環(huán)境質(zhì)量逐年惡化。因此，研究水體污染物包括水環(huán)境中的重金屬對養(yǎng)殖魚類的免疫毒性及其毒性機制，對養(yǎng)殖水環(huán)境保護和魚類病害防治均有重要的意義。腎臟是魚類重要的免疫器官，外界病原和污染物的刺激會使腎臟產(chǎn)生相應的免疫細胞和免疫因子，從而對魚體進行免疫調(diào)節(jié)。白細胞介素是魚體中的一類重要的免疫因子，它是由多種細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的一類細胞因子，由于最初是由白細胞產(chǎn)生又在白細胞間發(fā)揮作用，所以由此得名。迄今，已發(fā)現(xiàn)有33種白細胞介素參與免疫調(diào)節(jié)、造血、炎癥反應等過程[10]。近年來，白細胞介素作為魚類重要的免疫細胞因子，已得到廣泛研究，相繼在各種魚類中克隆得到了白細胞介素-1[11]、白細胞介素-2[12]、白細胞介素-4[13]、白細胞介素-8[14]和白細胞介素-10[15]的全長基因，這些白細胞介素在魚類的免疫調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著重要的作用。

3.1 草魚腎臟中白細胞介素-1β基因在銅和鎘脅迫下的表達變化

白細胞介素-1是在局部和全身炎癥反應中起關(guān)鍵作用的細胞因子，是重要的炎癥和一般起始反應的介質(zhì)，在級聯(lián)反應中可調(diào)控其他細胞因子的表達。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)11種白細胞介素-1家族成員，包括白細胞介素-1α、白細胞介素-1β、白細胞介素-1ra、白細胞介素-18、白細胞介素-1F5和白細胞介素-33等[16]，但目前在魚類中只發(fā)現(xiàn)了白細胞介素-1β和白細胞介素-18[17]。本試驗研究了Cu2+和Cd2+暴露對草魚腎臟白細胞介素-1β基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當Cu2+和Cd2+暴露到第8 d時，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露組、0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露組的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，說明長時間高質(zhì)量濃度的Cu2+和Cd2+暴露，對草魚的腎臟造成了一定的損傷，引起了草魚腎臟細胞的炎癥反應，其炎癥細胞因子白細胞介素-1β的基因表達量顯著升高，從而促進腎臟細胞的免疫調(diào)節(jié)。

3.2 草魚腎臟中白細胞介素-8基因在銅和鎘脅迫下的表達變化

白細胞介素-8是典型的促炎癥因子，也是一種CXC型趨化性細胞因子，對中性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T細胞有趨化作用，同時具有刺激血管生成、促有絲分裂和免疫調(diào)節(jié)等作用[18]。白細胞介素-8調(diào)節(jié)炎癥反應，對感染組織有一定的恢復作用[19]。本試驗中，草魚腎臟中白細胞介素-8基因表達量在較高質(zhì)量濃度和較長時間的Cu2+暴露下(0.40 mg/L，8 d;0.60 mg/L,4、6、8 d;0.80 mg/L,4、6、8 d)顯著高于對照組(P<0.05)，而在Cd2+暴露下，在暴露時間較長(6、8 d)時，各質(zhì)量濃度組的白細胞介素-8基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05)，但在高質(zhì)量濃度Cd2+(0.30、0.40 mg/L)暴露下，在僅暴露2、4 d時，白細胞介素-8基因表達量就已顯著高于對照組(P<0.05)。以上結(jié)果說明，白細胞介素-8基因的表達對Cd2+的暴露要比對Cu2+的暴露更加敏感，這可能是由于Cd2+對草魚的毒性要比Cu2+強，Cd2+的暴露比Cu2+暴露對草魚腎臟的損傷更快更嚴重，從而引起草魚腎臟細胞更加靈敏的炎癥反應。

3.3 草魚腎臟中白細胞介素-10基因在銅和鎘脅迫下的表達變化

白細胞介素-10又稱細胞因子合成抑制因子，參與炎癥反應并能緩解炎癥，對機體具有保護作用，在硬骨魚中具有免疫調(diào)節(jié)作用[20]。白細胞介素-10 mRNA的表達增加可抑制炎癥反應，緩解炎癥疾病，有助于治療炎癥[21]。本試驗中，高質(zhì)量濃度和長時間的Cu2+暴露(0.60 mg/L,8 d；0.80 mg/L,6、8 d)，以及高質(zhì)量濃度(0.20、0.30、0.40 mg/L)和長時間(6、8 d)的Cd2+暴露均使草魚腎臟中白細胞介素-10基因表達量顯著高于對照組(P<0.05)，這可能是腎臟細胞為了抑制和緩解Cu2+、Cd2+暴露對腎臟所造成的炎癥反應而大量合成白細胞介素-10所致。

3.4 草魚腎臟中白細胞介素基因表達量與銅和鎘的脅迫時間的關(guān)系

在本研究中，在0.80 mg/L Cu2+，0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下的草魚腎臟中白細胞介素-1β基因表達量，以及在0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露下的草魚腎臟中白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達量，均隨著暴露時間的增加而逐漸升高，在第8 d時達到最大值，且在第8 d時的基因表達量均顯著高于第2 d時(P<0.05)。這些結(jié)果說明在高質(zhì)量濃度的Cu2+暴露下的白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達量，以及在高質(zhì)量濃度Cd2+暴露下的白細胞介素-1β基因表達量，均與暴露時間呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，其表達量具有一定的時間依賴性。這可能是因為Cu2+和Cd2+暴露的時間越長，草魚腎臟受到的損傷越嚴重，其炎癥反應也越強烈，腎臟細胞產(chǎn)生的各種促炎癥因子和細胞因子合成抑制因子也越多。

4 結(jié) 論

總之，本研究利用實時熒光定量PCR初步分析了草魚在水體銅和鎘脅迫下，其腎臟中的免疫細胞因子——白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10的基因表達量的變化，試驗結(jié)果表明，高質(zhì)量濃度和長時間的Cu2+和Cd2+暴露會使草魚腎臟中的白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10基因表達量顯著增加，且高質(zhì)量濃度的Cu2+暴露下的白細胞介素-1β、白細胞介素-8和白細胞介素-10以及高質(zhì)量濃度Cd2+暴露下的白細胞介素-1β基因表達量具有一定的時間依賴性。本研究結(jié)果為后續(xù)深入研究重金屬對魚類的免疫毒性機制，提高環(huán)境污染條件下的魚類抗病力奠定了基礎(chǔ)。