叢玉婷，邢震宇，岳金榮，高相楠，張曉琳，柴曉杰

( 大連海洋大學(xué)，遼寧省省級高校水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

鹽藻(Dunaliellasalina)是己知最為耐鹽的單細胞真核生物，它能在低鹽和高鹽(NaCl的濃度為0.05～5.0 mol/L)的極端環(huán)境中生存，已引起了生物學(xué)家的廣泛關(guān)注，并成為耐鹽植物中的模式生物。一直以來，國內(nèi)外學(xué)者從滲透調(diào)節(jié)[1-3]、耐鹽基因[4-5]和鹽適應(yīng)蛋白質(zhì)[6-7]等多個方面對其進行了深入研究，并取得了一些研究成果。但鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號的分子機制目前尚不清楚。

鈣依賴蛋白激酶(CDPK)是一種新型的僅僅依賴Ca2+而不依賴鈣調(diào)素的蛋白激酶。當結(jié)合上Ca2+后該蛋白才具有活性，活化狀態(tài)的蛋白分子具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性[8]。鈣依賴蛋白激酶廣泛存在于植物、藻類及部分原生動物中，尚未在細菌、真菌、酵母、線蟲和動物中發(fā)現(xiàn)[9]。研究表明，鈣依賴蛋白激酶廣泛參與了Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的細胞碳氮代謝[10]、逆境脅迫應(yīng)答[11]、植物細胞膜系統(tǒng)的物質(zhì)運輸[12-13]、植物細胞肌動蛋白張力的調(diào)節(jié)[14-15]和生長發(fā)育調(diào)節(jié)[16]等諸多生物學(xué)過程，特別是在抗逆脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到了關(guān)鍵作用。因此，研究鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因的功能，對于闡明鹽藻耐鹽的分子機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要的科學(xué)意義。

筆者自鹽藻中提取其總RNA，以總RNA為模板，利用實時熒光定量PCR技術(shù)獲得鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因DsCDPK，構(gòu)建原核表達載體并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中成功表達；通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析在鹽脅迫條件下DsCDPK基因的表達情況，以期為進一步闡明鹽藻適應(yīng)高鹽環(huán)境的分子機制及鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號的分子途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽藻藻種由大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)實驗室提供。鹽藻培養(yǎng)液為康威試液[17]，25 ℃，12 h光照(光照度為1250 lx)，12 h黑暗，進行交替靜置培養(yǎng)。大腸桿菌BL21，pET-32a由本室保存，pMDTM19-T simple購自TaKaRa公司。

RNAiso Plus、DNA Marker DL-2000、限制性內(nèi)切酶、Taq酶、溶菌酶、IPTG、X-gal、DEPC、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)均購自TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司，其他分析純試劑均為科密歐生產(chǎn)廠家提供。

1.2 鹽藻總RNA的提取

取對數(shù)生長期的鹽藻10 mL(培養(yǎng)液含3.0 mol/L NaCl)，離心收集藻細胞，按照RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa, China)操作說明書提取總RNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA含量。

1.3 鹽藻DsCDPK基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)DsCDPK基因cDNA全長序列(GenBank: JQ964113)設(shè)計引物，N1:5′-CGGAATTCATGGGGTGTTCGGACAGCAAACCTG-3′(下劃線處為EcoRⅠ酶切位點)和N2:5′-GTCGACTCAAGCCGTGGCCTTGACCATGGGT -3′(下劃線處為SalⅠ酶切位點)。用總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，N1、N2為引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。目的片段與pMDTM19-T simple載體連接，獲得陽性單克隆。將重組質(zhì)粒pMDTM19-DsCDPK和pET-32a質(zhì)粒均用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，回收目的片段及載體大片段，T4 DNA 連接酶連接，重組克隆經(jīng)篩選、鑒定及測序。

1.4 鹽藻DsCDPK基因的原核表達及融合蛋白的可溶性分析

將測序正確的pET-32a-DsCDPK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(TIANGEN公司)感受態(tài)細胞，挑取單菌落，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp 50 mg/L)中，37 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min)24 h。取1 mL菌液轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp 50 mg/L)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，培養(yǎng)5 h后(同時設(shè)置對照)離心收集沉淀，再加入0.1 mol/L PBS 10 mL重懸，在冰浴中用超聲波細胞破碎儀進行破碎細胞20 min(功率30 W，工作9 s，間歇9 s)。8000 r/min離心5 min，分別收集上清液和沉淀，進行SDS-PAGE分析。

1.5 重組蛋白的Western雜交檢測

用超聲波細胞破碎儀破碎誘導(dǎo)后的菌液(冰浴，間歇時間為10 s，10 min)，12 000 r/min，4 ℃離心20 min后取上清液用0.45 μm濾膜抽濾。然后用His60鎳柱純化試劑盒(Clontech公司)純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)移(200 mA，3 h)至硝酸纖維素膜，用3% BSA 4 ℃封閉24 h，然后將硝酸纖維素膜置于用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液按1∶1000比例稀釋的Anti-His Antibody(TIANGEN公司)中，37 ℃孵育1 h，用0.01 mmol/L PBST洗滌3次，每次5 min。然后加入二抗(TIANGEN公司)HRP-IgG (1∶200)，37 ℃孵育1 h，洗滌(方法同上)，最后使用TMB顯色液(TIANGEN公司)進行顯色。

1.6 鹽脅迫下鹽藻DsCDPK基因的表達分析

鹽藻在培養(yǎng)液中生長至對數(shù)生長期(培養(yǎng)液含1.0 mol/L NaCl)，此時加入NaCl致使其鹽濃度達到3 mol/L。分別提取脅迫0(對照)、0.5、1、6、12、24 h的鹽藻的總RNA。用紫外分光光度法檢測RNA樣品的純度和含量，然后取各RNA樣品500 ng反轉(zhuǎn)錄。目的基因引物為D1:5′-GGACTTTGGGCTGTCTCGTTT-3′和D2: 5′-CTTGGCTGCGTCTGTGATCTT-3′；18S內(nèi)參基因引物為N1: 5′-TTGGGTAGTCGGGCTGGTC-3′，N2: 5′-CGCTGCGTTCTTCATCGTT-3′。熒光定量PCR反應(yīng)在ABI 7300 Real-Time PCR System上進行，反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (TaKaRa, China)10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和融解曲線。采取2-ΔΔCt法計算DsRab基因的相對表達量[20]。采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽藻DsCDPK基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建

以鹽藻總RNA為模板進行PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物(圖1a)。在約2000 bp位置有一條清晰的條帶，與試驗預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒pMD19-T Simpie-DsCDPK經(jīng)雙酶切及質(zhì)粒PCR檢測，結(jié)果表明，目的片段已連接到克隆載體pMD19-T simple上(圖1b)。重組質(zhì)粒的測序結(jié)果與目的基因序列比對后，與DsCDPK開放閱讀框完全一致，表明重組質(zhì)粒pMD19-T Simpie-DsCDPK構(gòu)建成功。將已經(jīng)鑒定正確的克隆載體pMD19-T Simpie-DsCDPK和原核表達載體pET-32a進行EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，經(jīng)T4連接酶連接，構(gòu)建原核表達載體pET-32a-DsCDPK，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，篩選出陽性單克隆。經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切和質(zhì)粒PCR檢測(圖1c)，結(jié)果顯示，目的片段大小與預(yù)期一致，說明目的片段與原核表達載體正確連接。測序結(jié)果表明，擴增片段為1650 bp，與DsCDPK(GenBank: JQ964113)開放閱讀框完全一致，讀碼框正確，原核表達載體pET-32a-DsCDPK構(gòu)建成功。

圖1 鹽藻DsCDPK的PCR及酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析a.M: DNA marker DL-2000，1: PCR 產(chǎn)物；b.M: DNA marker DL-5000，1: 酶切產(chǎn)物，2: PCR產(chǎn)物；c.M: DNA marker DL-15 000，1: 重組質(zhì)粒，2: 酶切產(chǎn)物，3: PCR產(chǎn)物.

2.2 鹽藻DsCDPK基因的原核表達及重組蛋白的Western雜交檢測

將pET-32a-DsCDPK及pET-32a轉(zhuǎn)化至表達菌大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，含有空載體pET-32a的表達菌為對照組，含有pET-32a-DsCDPK重組質(zhì)粒的表達菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，電泳結(jié)果顯示，約在82 ku處有一條明顯增強的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(融合蛋白包括預(yù)計分子量為61 ku的DsCDPK蛋白和21 ku的His標簽蛋白)，而含有空載體pET-32a的表達菌，未顯示該目的條帶，表明DsCDPK基因在大腸桿菌中成功表達。誘導(dǎo)后的大腸桿菌表達菌經(jīng)超聲波破碎，取上清液和沉淀分別電泳，結(jié)果表明，上清液和沉淀均可見清晰的目的蛋白條帶，說明目的蛋白為部分可溶性表達(圖2)?？扇苄缘鞍捉?jīng)His60鎳柱純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物經(jīng)Western blotting檢測，在82 ku處有明顯的單一蛋白條帶(圖3)，說明融合蛋白能與抗His單克隆抗體特異性結(jié)合，具有良好的免疫學(xué)活性，初步證明純化的蛋白就是帶有His標簽的鈣依賴蛋白激酶。

圖2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達和表達形式分析M：標準蛋白分子量； 1：含pET-32a質(zhì)粒的表達菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)； 2：含pET-32a-DsCDPK 的表達菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在上清液中的表達； 3：含pET-32a-DsCDPK的表達菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在沉淀中的表達.

圖3 Western blotting檢測M：標準蛋白分子量，1：純化的融合蛋白.

2.3 鹽脅迫條件下DsCDPK基因的表達分析

通過實時熒光定量PCR方法分析了鹽藻DsCDPK基因在鹽脅迫條件下的表達模式，結(jié)果見圖3。在0 h正常生長條件下(未脅迫)，DsCDPK基因的表達量很低，當受到3.0 mol/L NaCl脅迫時，DsCDPK基因的表達量明顯升高，在脅迫1 h時表達量是未脅迫時的3倍，并且達到最高，差異達極顯著水平(P<0.01)。隨著脅迫時間的延長，表達量有所下降，但仍高于正常情況下的表達量(圖4)，表明DsCDPK為鹽脅迫上調(diào)基因，可能在鹽藻應(yīng)答高鹽脅迫的生理過程中起重要作用。

圖4 鹽藻DsCDPK 基因在不同鹽脅迫時間下的表達分析

3 討 論

3.1 鈣依賴蛋白激酶參與植物應(yīng)答鹽脅迫過程的調(diào)控

細胞在各種外界信號刺激下做出的應(yīng)答反應(yīng)主要是通過蛋白激酶對通路蛋白的磷酸化修飾、蛋白質(zhì)的相互作用以及下游靶基因表達的改變等一系列生化事件最后導(dǎo)致特定的生物效應(yīng)。研究表明，鈣依賴蛋白激酶廣泛參與了逆境脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育等多種Ca2+信號傳遞途徑中信號的介導(dǎo)。鹽脅迫、干旱脅迫、冷脅迫、光照及滲透脅迫等多種逆境脅迫，均能誘導(dǎo)鈣依賴蛋白激酶基因的特異性表達并引起鈣依賴蛋白激酶在 mRNA水平的特異性積累。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的鈣依賴蛋白激酶基因cATCDPK1和cATCDPK2，在高鹽和干旱脅迫下其mRNA水平的表達被迅速誘導(dǎo)[11]。Saijo等[18]在轉(zhuǎn)基因水稻中對鈣依賴蛋白激酶基因進行了鹽脅迫、干旱脅迫和冷脅迫的表達分析，研究發(fā)現(xiàn)，水稻應(yīng)對鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)時OsCDPK7基因的表達量增加。Kiselev等[19]研究發(fā)現(xiàn)，人參鈣依賴蛋白激酶基因PgCDPK1c、PgCDPK2c和PgCDPK4a在60 mmol/L NaCl鹽濃度下表達量明顯增加。Romeis等[20]發(fā)現(xiàn)，低滲脅迫能夠誘導(dǎo)煙草鈣依賴蛋白激酶基因NtCDPK2的磷酸化及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的增加。Yuasa等[21]在半咸水輪藻(Lamprothamniumsuccinctum)中發(fā)現(xiàn)了鈣依賴蛋白激酶，并證明其參與了低滲條件下細胞體積的調(diào)節(jié)。而有關(guān)鹽藻鈣依賴蛋白激酶基因在該方面的研究尚未見報道。

本試驗采用Real-time PCR技術(shù)分析了鹽藻在高鹽脅迫條件下的表達模式。研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下鹽藻DsCDPK基因的表達量很低，當受到3 mol/L NaCl脅迫時，DsCDPK基因的表達量明顯升高，脅迫1 h時表達量達到最高。說明鹽藻DsCDPK基因受鹽脅迫誘導(dǎo)。Harmon等[22]研究表明，鈣依賴蛋白激酶可調(diào)節(jié)許多底物包括轉(zhuǎn)錄因子、代謝酶類、離子通道和離子泵、骨架蛋白等。推測鈣依賴蛋白激酶可能調(diào)控鹽藻在高鹽脅迫下迅速的體積變化、離子的轉(zhuǎn)運和細胞增殖等，在鹽藻應(yīng)答高鹽脅迫的生理過程中可能發(fā)揮著非常重要的作用。

3.2 鈣依賴蛋白激酶的原核表達與純化

在前期工作中，克隆到了一種鈣依賴蛋白激酶基因[23]，為進一步研究該蛋白激酶的性質(zhì)及功能，需要獲得高純度的可溶性蛋白。由于大腸桿菌表達系統(tǒng)具有易于培養(yǎng)和控制、操作簡單、表達蛋白產(chǎn)量高、需時短、試驗成本低、表達產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點，在科研和生產(chǎn)領(lǐng)域已成為最常用的表達外源蛋白的宿主[24]。本研究中融合蛋白的表達采用原核表達系統(tǒng)，以大腸桿菌BL21為表達菌，將構(gòu)建的原核表達載體pET-32a-DsCDPK導(dǎo)入受體菌，融合蛋白在大腸桿菌中獲得了成功表達。但外源基因在宿主細胞的表達水平，不僅依賴于宿主本身，還受誘導(dǎo)條件、目的基因核苷酸序列組成、蛋白質(zhì)的性質(zhì)等因素的影響。有研究報道，如果目的基因的GC含量大于70%，可能會降低其在宿主細胞中的表達水平[25-27]。通過Bioedit軟件分析發(fā)現(xiàn)，DsCDPK基因開放閱讀框基因序列的GC含量為54.52%，對表達水平的影響不大。有研究表明，親水性的蛋白質(zhì)較疏水性的膜蛋白更易表達[28-29]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DsCDPK蛋白為親水性蛋白質(zhì)，這將提高其表達可溶性蛋白質(zhì)的效率。經(jīng)過反復(fù)摸索誘導(dǎo)條件，最后確定DsCDPK基因最適表達條件為：溫度28 ℃，IPTG濃度0.6 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)時間4 h。將獲得的融合蛋白進行可溶性分析，發(fā)現(xiàn)在破碎細胞的上清液中表達量較多，而在包涵體中表達量較小，結(jié)果很理想。

為獲得高純度的融合蛋白，將收集的可溶性蛋白經(jīng)His60鎳柱純化試劑盒純化，能識別His標簽的融合蛋白被吸附在柱子上，再經(jīng)過洗脫，得到純度較高的融合蛋白。為進一步確定得到的融合蛋白是否為目的蛋白，對純化的融合蛋白進行Western雜交檢測。結(jié)果顯示，融合蛋白與羊抗鼠IgG單抗進行了特異性的結(jié)合，并且具有良好的免疫學(xué)活性，初步證明純化的蛋白就是帶有His標簽的鈣依賴蛋白激酶。后續(xù)的工作將利用獲得的DsCDPK蛋白制備抗體，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)、液相二級質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)方法篩選出與鈣依賴蛋白激酶相互作用的蛋白質(zhì)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，在蛋白質(zhì)組學(xué)的水平上研究鈣依賴蛋白激酶的功能，這將為進一步闡明鈣依賴蛋白激酶在鹽藻應(yīng)答鹽脅迫信號傳遞途徑中的作用提供新的理論依據(jù)。